硬腦膜缺損及繼發性腦脊液（CSF）滲漏通常出現在外傷或神經外科手術中，并伴隨著一系列嚴重的并發癥甚至死亡。使用具有阻斷滲漏、防止粘連和硬腦膜重建等功能的合格硬腦膜替代物是一種很有前景的治療途徑。然而，即使一些產品已投入臨床應用，但沒有一種替代品能夠達到所需的多功能性。本研究旨在設計并制備一種具有理想多功能的硬腦膜修復復合材料。通過仿生天然硬腦膜的結構和成分，研究者采用L-聚乳酸（PLLA）、殼聚糖（CS）、明膠和脫細胞小腸粘膜下層（SIS）粉末成功制備了三層復合材料。然后，開發了一系列特定的設備和技術來研究其性能。結果表明，在組分間良好的協同相互作用下，可以獲得令人滿意的結構穩定性。此外，上述研究結果表明，該仿生三層復合材料具有良好的堵漏、防粘連、抗菌、硬腦膜重建等功能，有望成為硬腦膜修復的理想材料。
圖1.主要研究過程示意圖。
圖2.研究中使用的一些實驗設備和模型。（A）模擬體外降解生理環境的硬腦膜缺損模型。缺損模型的示意圖（a1）和物理圖（a2）。用替代品（頂部的水凝膠層）固定的缺損模型（a3）。（B）建立幾何模型的過程。基于25歲健康男性CT圖像（b1）重建顱骨（b2），基于白色虛線上方的顱骨部分，構建包括顱骨、修復材料、硬腦膜的幾何模型（b3）。（C）成纖維細胞屏障功能實驗裝置。器件的示意圖（c1）和物理圖（c2）。用替代品（c3）固定的裝置；細胞和材料在裝置中的共培養（c4）。比例尺：1cm。
圖3.三層復合材料的宏觀和微觀形貌。（A）三層復合材料的宏觀形貌，包括a1）頂面和底面；a2）橫截面；a3）水凝膠。比例尺：1cm。（B）復合材料頂面和底面以及橫截面的SEM圖像。組合界面中的PLLA和CS/PLLA靜電紡絲纖維和水凝膠分別用藍色、紅色和黃色箭頭表示。在水凝膠的SEM圖像中用紅色箭頭表示均勻分布在水凝膠內的脫細胞SIS粉末。
圖4.相鄰兩層之間的組合。（A）PLLA和CS/PLLA紡絲薄膜的組合。PLLA與CS/PLLA紡絲薄膜組合的宏觀形貌（a1）和示意圖（a2）（PLLA和CS/PLLA靜電紡絲纖維分別用黃色和綠色箭頭表示）；PLLA、CS/PLLA紡絲薄膜和雙層的SEM圖片（a3）和接觸角（a4）。（B）水凝膠和CS/PLLA紡絲薄膜的組合。PLLA靜電紡絲薄膜-水凝膠偶聯物（b1）和CS/PLLA靜電紡絲薄膜-水凝膠偶聯物（b2）的SEM圖，圖中黃色和紅色箭頭分別代表PLLA納米纖維和CS/PLLA納米纖維；CS/PLLA納米纖維與水凝膠之間的化學相互作用示意圖（b3）。
圖5.用鑷子彎曲、冷凍干燥和拉伸后三層復合材料的結構穩定性。（A）用鑷子（a1）彎曲和冷凍干燥（a3）后復合材料的直觀表觀。將PLLA-水凝膠偶聯物彎曲作為對照（a2）（紅色虛線為紡絲薄膜原處，藍色虛線為未脫落時水凝膠表面PLLA膜的邊緣）；比例尺：1cm。（B）不同層和復合材料的應力-應變曲線。
圖6.體外降解0、10、20和30天后三層復合材料上下表面和橫截面的SEM圖像。橫截面SEM圖像中白色虛線之間的部分是組合界面。
圖7.顱內壓生理極限下硬腦膜替代物的最大力學性能。（A）主應力和（B）主彈性應變。
圖8.成纖維細胞抗滲漏功能和屏障功能的體外研究結果。（A）抗滲漏功能研究包括無壓液滴滲透（a1-a6）和熒光染料滲透實驗（a7-a10）。滴下紅色液滴0、15和30分鐘后替代品的頂面和底面（a1-a3）；紅色液滴掉落前的初始狀態（a4）；紅色液滴掉落30分鐘后，將紅色液滴清洗干凈后的上下表面狀態（a5-a6）。當熒光染料液滴穿透水凝膠表面5、10、60和120分鐘時，復合材料的熒光顯微鏡圖像（黃色虛線代表靜電紡絲的下表面）（a7-a10）。比例尺：1cm。（B）細胞培養1、3和5天后，替代品的頂面和底面以及孔板底部的細胞生長。（熒光顯微鏡圖像）比例尺：50μm。
圖9.含0-3％CS的水凝膠對金黃色葡萄球菌（A）和大腸桿菌（B）的抗菌活性。金黃色葡萄球菌（a1-a4）和大腸桿菌（b1-b4）物種粘附在含0-3％CS的水凝膠上的SEM圖像。對大腸桿菌（a5）和金黃色葡萄球菌（b5）浮游細菌（Rp）的抗菌率。***p<0.001。
圖10.培養過程中細胞在不同支架上的擴散和附著以及SIS粉末的釋放。（A）1、3、5、7天后，在空白板、PLLA膜和有無SIS粉末的水凝膠表面培養的BALB/C 3T3細胞的熒光顯微鏡圖像和（B）CCK-8分析。（C）培養1天和5天后接種在PLLA膜和有無SIS粉末的水凝膠上的細胞的SEM圖像。（D）培養0、1、3、5和7天后，用Cy5.5 NHS染色的SIS粉末負載水凝膠的熒光強度。通過熒光顯微鏡觀察SIS粉末的分布。數據表示為平均值±SD（n=5），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖11.生物相容性、生物活性和結構穩定性的體內研究結果。植入物的H&E（A）以及Masson三色染色（C）。基于HE圖像（A），對PLLA膜中細胞浸潤深度的定量分析（B）。靜電紡絲膜中的細胞浸潤由黑色虛線表示。標有黑色“*”的區域代表植入物。植入4周后剩余水凝膠用藍色箭頭標記。（C）中的紅色箭頭代表降解區域的新血管。手術后2周時植入復合材料的H&E以及Masson三色染色（D），顯示出復合材料優異的體內結構穩定性和有效的防粘連能力。PLLA靜電紡絲膜中的細胞浸潤用藍色箭頭表示，中間層用紅色箭頭表示。數據表示為平均值±SD（n=5）。*p<0.05，***p<0.001。
圖12.血管化的體內研究結果。（A）植入7、14和28天后水凝膠組以及植入28天的PLLA膜和空白組的CD31免疫組織化學染色，alpha-SMA（綠色）和CD31（紅色）免疫熒光染色。紅色箭頭表示新生血管。（B）血管密度和直徑的定量分析，包括第7、14和28天不同直徑的血管密度（b1），以及第28天不同組的血管密度（b2）。數據表示為平均值±SD（n=5）。**p<0.01，***p<0.001。
圖13.巨噬細胞極化的定性和定量研究結果。（A）植入3、7和14天后DAPI（藍色）、CD68（紅色）和Arg-1/CCR7（綠色）的免疫熒光染色圖像。（B）DAPI群體中CD68+細胞比例（b1）、CD68+群體中CCR7+細胞比例（b2）和CD68+群體中Arg-1+細胞比例的定量分析（b3）。統計學顯著性差異由*p<0.05、**p<0.01或***p<0.001表示，經學生t檢驗確定。
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