DOI: 10.1021/acsbiomaterials.0c00893
與生精小管最具相似性的3D基底的工程設計將有助于由干細胞體外生產功能性精子細胞。在此，作者介紹了一種接種有支持細胞的3D電紡明膠（EG）基底，并測定了其指導胚胎干細胞（ESCs）向生殖細胞分化的潛力。采用靜電紡絲法制備了EG，通過MTT法和細胞貼壁試驗證實了其在SEM下的形態以及對支持細胞和ESCs的細胞生物相容性。由胚胎干細胞形成胚狀體（EBs），與支持細胞共培養，并用BMP4連續誘導3天和7天，使EBs向生殖細胞分化。通過免疫細胞化學（ICC）、流式細胞術和RT-PCR研究了四個實驗組中EB（在明膠涂覆細胞培養板上培養EBs），支架/EB（在EG上培養EBs），ESCs/Ser（在沒有EG的明膠涂覆細胞培養板上共培養EBs和支持細胞），以及支架/EB/Ser（在EG上共培養EB和支持細胞）的分化情況。與EB組相比，所有實驗組的MVH（生殖細胞特異性標志物）表達均顯著增加，而c-KIT（干細胞標志物）表達則降低。ICC和流式細胞儀檢測顯示，與其他組相比，支架/EB/Ser在分化后3天和7天具有最高的MVH水平和最低的c-KIT表達。RT-PCR結果顯示，與EB組相比，支架/EB中的生殖細胞標志物（Dazl）顯著增加，而ESCs干細胞標志物（Nanog）顯著降低。與支架/EB組相比，支架/EB/Ser中的生殖細胞標志物Gcna、Stella、Mvh、Stra8、Piwil2和Dazl顯著增加。該研究結果顯示，EG支架可以提供一個與天然生精小管微/納米結構極具相似性的良好基質，并為支持細胞與EBs通信提供了平臺，以使ESCs生長和分化為生殖細胞。
圖1.研究設計的示意圖。簡而言之，通過靜電紡絲技術制備了電紡明膠墊，并接種了從小鼠睪丸中分離的支持細胞和C57Bl/6小鼠ESCs衍生的EBs。用BMP4處理細胞以誘導生殖細胞譜系分化。通過使用流式細胞儀/免疫組織化學和實時PCR評估生殖細胞和ESCs特異性標志物來測定分化。
圖2.（a）與戊二醛交聯前后的電紡明膠（EG）的SEM顯微照片。（b）在光學顯微鏡下觀察支持細胞和胚胎干細胞（ESCs）的培養。（c）在掃描電鏡下觀察EG墊上的支持細胞、ESCs以及共培養的支持細胞和ESCs。（d）在EG上培養1、3和7天后細胞的細胞活性。實驗組之間的比較：ESCs-EG組與ESCs-GP組比較；ESC/Ser-EG組與ESC/Ser-GP組比較。
圖3.在四個實驗組中，在誘導分化的第3天（a）和第7天（b）進行c-KIT免疫染色：EB：在明膠涂覆細胞培養板上培養EBs；支架/EB：在EG上培養EBs；ESCs/Ser：在沒有EG的明膠涂覆細胞培養板上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞；支架/EB/Ser：在EG上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞。
圖4.在四個實驗組中，在誘導分化的第3天（a）和第7天（b）進行MVH免疫染色：EB：在明膠涂覆細胞培養板上培養EBs；支架/EB：在EG上培養EBs；支架/EB/Ser：在EG上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞；ESCs/Ser：在沒有EG的細胞培養板上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞。
圖5.免疫細胞化學染色，比較四個實驗組在分化第3天和第7天表達c-KIT和MVH的細胞百分比：EB：在明膠涂覆細胞培養板上培養EBs；支架/EB：在EG上培養EBs；支架/EB/Ser：在EG上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞；ESCs/Ser：在沒有EG的細胞培養板上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞。星號表示顯著差異（p≤0.05）。
圖6.用于細胞表型測定的流式細胞儀分析。在四個實驗組中，在誘導分化的第3天和第7天表達c-KIT或MVH的細胞百分比：EB：在明膠涂覆細胞培養板上培養EBs；支架/EB：在EG上培養EBs；支架/EB/Ser：在EG上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞；ESCs/Ser：在沒有EG的細胞培養板上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞。*和?分別表示與EB和EB/Ser的顯著差異。
圖7.比較實驗組間分化第7天多能性基因（Oct4，c-Kit，Nanog，c-Myc）和種系基因（GCNA，Stella，MVH，Stra8，Piwil2，DAZL）的相對表達（倍數）。將支架/EB組（在EG上培養EBs）與EB組（在明膠涂覆細胞培養板上培養EBs）中的表達水平進行比較。將支架/EB/Ser組（在EG上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞）與EB/Ser組（在沒有EG的明膠涂覆細胞培養板上共培養EBs和絲裂霉素C處理的支持細胞）進行比較。星號表示顯著差異（p≤0.05）。
