電紡聚（3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯）/磷酸八鈣納米纖維膜用于有效引導骨再生

DOI:10.1016/j.msec.2020.110763 

用于引導性骨再生（GBR）的膜需要具有較高的機械強度、生物相容性、生物降解性、成骨性和骨誘導性。在本研究中，聚（3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯）（P（3HB-co-4HB））/磷酸八鈣（OCP）（P（3HB-co-4HB）/OCP）納米纖維膜是用兩種不同比率P（3HB-co-4HB）與OCP制備的（P（3HB-co-4HB）:OCP=95:5%和90:10%，分別稱為P（3HB-co-4HB）/OCP（5）和P（3HB-co-4HB）/OCP（10）]，用于引導性骨再生。利用間充質干細胞（MSCs）在體外和顱骨缺損大鼠模型中分析了P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜的成骨性和骨誘導性。與P（3HB-co-4HB）納米纖維膜相比，復合P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜的纖維尺寸減小，拉伸強度增強。在體外實驗中，P（3HB-co-4HB）/OCP膜促進MSCs的細胞生長和成骨分化，并且優于P（3HB-co-4HB）膜。覆蓋顱骨缺損后，P（3HB-co-4HB）/OCP膜比P（3HB-co-4HB）膜更易于促進新骨形成，其組織學評價和顯微CT分析顯示骨體積/總體積（BV/TV）比值和骨密度（BMD）較高。具有較高OCP含量的P（3HB-co-4HB）/OCP（10）膜比P（3HB-co-4HB）/OCP（5）膜具有更大的剛度和骨誘導性，證明了OCP在復合膜中的作用。總體結果表明，電紡P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜有望實現GBR的臨床應用。

圖1.靜電紡絲納米纖維膜的纖維直徑分布和平均直徑。a-c（n=3）：SEM圖像顯示，所有納米纖維尺寸均勻、光滑、細長且具有3D結構。d-f，j（n=3）：TEM結果表明，OCP（e，f中的黑色晶體）隨機分散在纖維內部，形成粘附的粒狀纖維表面。g-i（n=150）：P（3HB-co-4HB）/ OCP（10）膜的纖維較細，平均直徑比其他兩個膜要小。值表示為平均值±標準偏差。

圖2.P（3HB-co-4HB）/OCP電紡納米纖維膜的表征。a：FTIR（n=3）結果表明，P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜具有OCP的特征峰和P（3HB-co-4HB）的吸收峰。b：XRD（n=3）分析顯示，隨著OCP的增加，P（3HB-co-4HB）/OCP膜中OCP的峰強度增加。c-d：機械性能（n=6）表明，OCP的引入顯著增強了P（3HB-co-4HB）納米纖維膜的機械強度。e：28天后P（3HB-co-4HB）/OCP（10）膜的殘留重量較小（n=3），表明P（3HB-co-4HB）/OCP膜的變性速率稍快于P（3HB-co-4HB）膜。值表示為平均值±標準偏差，*，P<0.05； **，P<0.01；***，P<0.001，相對于對照組；#，P<0.05；##，P<0.01；###，P<0.001，在基于P(3HB-co-4HB)-的組中。

圖3.P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜促進了MSCs的粘附和增殖。a：MTT結果顯示，與P（3HB-co-4HB）相比，P（3HB-co-4HB）/OCP膜具有更高的細胞活力，尤其是P（3HB-co-4HB）/OCP（10）。通過MTT分析測試了MSCs在納米纖維膜上的增殖。b：流式細胞儀分析表明，OCP摻入納米纖維膜可增強MSCs的存活率。 c：SEM圖像顯示，MSCs在P（3HB-co-4HB）/OCP膜上分散平滑，幾乎融合。值表示為平均值±標準偏差，n=6。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，相對于對照組；#，P<0.05；##，P<0.01；###，P<0.001，在基于P（3HB-co-4HB）-的組中。

圖4.體外培養后，含OCP的納米纖維膜上調了MSCs的成骨相關基因。成骨相關基因（包括COL1a1、RUNX2、BMP-2、OCN、OPN）的表達水平在P（3HB-co-4HB）/OCP組比P（3HB-co-4HB）組高得多。值表示為平均值±標準偏差，n=3。*，P<0.05； **，P<0.01；***，P<0.001，相對于對照組；#，P<0.05；##，P<0.01；###，P<0.001，在基于P（3HB-co-4HB）-的組中。

圖5. P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜刺激了MSCs的成骨分化和生物礦化。a：在納米纖維膜組中，第14天時ALP活性顯著增加，尤其是P（3HB-co-4HB）/OCP（10）組。b：ARS染色顯示，在P（3HB-co-4HB）納米纖維膜上觀察到的礦物質較少，而在P（3HB-co-4HB）/OCP膜上觀察到較多的鈣沉積。值表示為平均值±標準偏差，n=3。*P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，相對于對照組；#，P<0.05；##，P<0.01；###，P<0.001，在基于P（3HB-co-4HB）-的組中。

圖6.P（3HB-co-4HB）/OCP（10）納米纖維膜用作功能性GBR膜，可用于修復重要尺寸的顱骨缺損。a：Micro-CT顯示未處理的側面未觀察到新骨形成或礦化（右）。P（3HB-co-4HB）/OCP（10）膜（左）比P（3HB-co-4HB）（左）顯示出更高的礦化骨形成。b：根據Micro-CT結果，P（3HB-co-4HB）/OCP（10）組的骨體積/總體積（BV/TV）比值要比其他組高得多。c：P（3HB-co-4HB）和P（3HB-co-4HB）/OCP（10）組的骨礦物質密度（BMD）在8周時顯著高于未治療組。值表示為平均值±標準偏差，n=6。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P <0.001，相對于對照組；#，P<0.05；##，P<0.01；###，P <0.001，在基于P（3HB-co-4HB）-的組中。

圖7.P（3HB-co-4HB）/OCP納米纖維膜促進了骨再生和缺損修復。a：HE染色顯示P（3HB-co-4HB）/OCP（10）側由幾乎完全連接的再生骨修復，在第8周時，新組織和天然組織之間的邊緣難以辨認。b：Masson的三色染色顯示P（3HB-co-4HB）側部分骨缺損修復，幾乎沒有新骨，而未治療側則在8周時僅填充了結締組織，修復得較差。每組檢測6個樣品。