DOI: 10.1039/D0BM00833H
越來越多的證據表明，三維（3D）體外細胞培養系統在模擬天然體內微環境方面，優于傳統的二維（2D）單層培養。將組織工程3D培養模型與干細胞技術相結合，有助于深入研究阿爾茨海默氏病（AD）的發病機理。然而，現有的AD三維神經元模型過表達突變基因或在組成、生物學特性和細胞分化階段具有異質性。在此，研究者將患者的誘導性多能干細胞（iPSC）衍生的神經祖細胞（NPC）封裝在通過濕法靜電紡絲制備的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微形態支架中，以開發AD的新型3D培養模型。首先，研究者通過優化各種工藝參數（例如纖維直徑、孔徑、孔隙率和親水性）來增強支架內的細胞浸潤和分布。接下來，比較了2D單層對照和3D培養中神經干細胞的關鍵特征，包括活性、增殖和分化。3D微纖維基質可減少細胞增殖，并在培養7天之內顯著加速神經元分化。此外，與年齡匹配的健康對照組相比，3D培養可自發地增強攜帶家族性AD（FAD）突變的分化神經元中的致病性淀粉樣β42（Aβ42）和磷酸化tau水平。總體而言，基于可調節支架的3D神經元培養平臺可作為一種合適的體外模型，該模型可有力地再現并加速FAD-iPSC衍生神經元的致病特征。
圖1.3D PLGA超細纖維支架的制備和孔徑優化。（A）濕法靜電紡絲工藝示意圖；（B）3D PLGA支架的孔徑隨微纖維濃度的變化而變化；（C）FE-SEM顯微照片，分別顯示2D和3D支架中的微纖維形態和分布（比例尺：10μm）；PLGA（D）2D和（E）3D超細纖維支架的孔徑分布；數據表示為平均值±SD（n=3）。
圖2.3D PLGA超細纖維支架的表征。（A）3D微纖維支架在等離子體處理之前和之后的水接觸角；（B）PLGA微纖維表面的低分辨率XPS光譜：（a）不使用和（b）使用大氣等離子體處理（300s）；（C）在干燥和潮濕條件下測試的3D PLGA超細纖維支架的應力-應變曲線；（D）干濕條件下測定的壓縮模量；數據表示為平均值±SD（n=5），***p<0.001。
圖3.3D PLGA超細纖維支架內NPC的封裝和表征。（A）hESC/iPSC衍生神經細胞培養示意圖，說明了2D和3D培養的軌道式接種（80rpm；20分鐘）、分化方案和染色時間表。（B）共聚焦熒光顯微鏡圖像，其顯示（i）切片后的3D微纖維支架的橫截面（虛線表示3D支架的頂面）；（ii，iii）通過對D13上的TuJ1（綠色）和Nestin（紅色）標記物進行染色以評估3D支架中iPSC衍生NPCs（8529細胞系）的細胞浸潤、分布和分化；（iv）通過Ki67（綠色）標記物評估細胞增殖，（v）通過D13上的hESC衍生NPCs的TuJ1（紅色）標記物顯示有神經突形成的細胞分化；細胞核用DAPI復染（藍色）；（vi）支架橫截面的SEM圖像，顯示了在2000放大倍率下的細胞形態及其在超細纖維上的附著情況。
圖4.3D PLGA超細纖維支架支持封裝細胞的存活。（A）共聚焦熒光顯微鏡圖像顯示對D13和D19上的裂解caspase 3（CC3）（紅色）標記物進行染色以評估2D和3D培養中的細胞死亡。細胞核用DAPI復染（藍色）；（B）免疫染色結果的定量，顯示在D13和D19上標準化為DAPI的細胞死亡標記物CC3的陽性染色百分比；數據表示為平均值±SD（n=3），*p<0.05，**p<0.01；比例尺：50μm。
圖5.3D PLGA超細纖維支架降低了細胞增殖率。（A）共聚焦熒光顯微鏡圖像，表明在2D和3D培養物中hESC衍生NPC的增殖，如在D13和D19上的Ki67（綠色）標記物染色；細胞核用DAPI復染（藍色）；（B）免疫染色結果的定量，顯示在D13和D19上標準化為DAPI的細胞增殖標記物Ki67的陽性染色百分比；（C）在D19上通過2D和3D形式培養的細胞中Ki67表達的qPCR分析；數據表示為平均值±SD（n=3），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；比例尺：50μm。
圖6.3D PLGA超細纖維支架可加速神經元分化。（A）共聚焦熒光顯微鏡圖像，表明對D13和D19上的TuJ1（紅色）和NeuN（紅色）標記物進行染色以評估2D和3D培養物中hESC衍生的神經元分化；細胞核用DAPI復染（藍色）；（B）免疫染色結果的定量，顯示在D13和D19上標準化為DAPI的神經元分化標記物Tuj1和NeuN的陽性染色百分比；（C）在D19上通過2D和3D形式培養的細胞中NeuN表達的qPCR分析；數據表示為平均值±SD（n=3），**p<0.01，***p<0.001；比例尺：50μm。
圖7.3D PLGA超細纖維支架可擴增AD致病標記物的表達。（A）2D培養和（B）3D培養的對照（8529，4148）和FAD（6840，9908）細胞系中Aβ42表達水平的ELISA分析；（C）Western印跡，描繪了2D和3D培養的對照和FAD細胞系中p-tau的水平；基于Western blot，定量（D）2D培養和（E）3D培養的對照和FAD細胞系中的p-tau水平；數據表示為平均值±SD（n=3），*p<0.05，**p<0.01。
