DOI: 10.1002/term.3100
開發兒科應用的組織工程化血管移植物（TEVGs）必須考慮與該患者群體相關的獨特因素。雖然新生細胞的彈性形成潛能增加為克服體外彈性形成的長期挑戰提供了機會，但新生兒患者對自體組織獲取的耐受性較低，這就需要具有生長潛力的移植物。本研究的目的是應用多管齊下的策略，結合臍帶衍生材料在功能性小兒TEVGs的制作中促進彈性生成。研究者進行了一項初步的概念驗證研究，以從人臍帶血樣本中提取纖維蛋白原，通過靜電紡絲制備納米纖維蛋白原支架。將人臍帶動脈平滑肌細胞（hUASMCs）植入支架，使用免疫熒光顯微鏡觀察支架內新組織的形成。隨后，使用聚己內酯（PCL）增強的豬血源纖維蛋白原支架（使用與臍帶血纖維蛋白原相同的方案進行分離）開發了一種軋制薄板移植物，該移植物采用地形和生化指導線索來促進彈性生成和細胞定向。這種方法制備的TEVG具有強大的機械性能、細胞外基質（ECM）的仿生排列以及彈性纖維相關蛋白（EFRP）的豐富表達。本研究結果有助于進一步開發小兒TEVGs，探索支架微納米結構對血管細胞功能和ECM生成的影響。
圖1.電紡纖維蛋白原支架的表征。（A）顯示電紡絲蛋白原TEVG支架的宏觀圖像。（B，C）細胞接種的人臍帶衍生支架的免疫組織化學分析；（B）DAPI核復染的陰性染色對照（藍色），（C）纖維蛋白原的陽性染色（紅色）表明在電紡絲纖維蛋白原支架中檢測到了目標表位。（D-F）（D）商業人、（E）臍帶來源和（F）豬血來源的電紡纖維蛋白原支架的掃描電子顯微照片。（G）電紡絲支架組內的平均纖維直徑，根據SEM顯微照片計算（n=6）。（H）電紡支架組的干支架模量，各組之間未檢測到顯著性差異。（I）經證實商業纖維蛋白原的極限抗張強度（UTS）比臍帶或豬血源支架顯著更高（p<0.05）。比例尺：B，C=50μm；D-F=5μm。
圖2.臍帶支架中的細胞和基質活性。（A-H）與hUASMC接種的臍帶支架（B，D，F，H）相比，臍帶動脈（A，C，E，G）中的基質蛋白表達。（GL）與hUASMC接種的臍帶支架相比（J，L），臍帶動脈（I，K）中的表型標志物表達。hUASMCs及其周圍基質對I型膠原蛋白、α-SMA和彈性蛋白原呈陽性染色，而對彈性蛋白纖維、原纖維蛋白2或鈣調蛋白則不適用。比例尺=50μm。
圖3.豬血源纖維蛋白原支架中的新組織發育。（A，B）培養2和4周后的I型膠原蛋白染色。（C，D）培養2周和4周后，接種hUASMCs中的α-SMA表達。（E-H）培養4周后新組織中的彈性蛋白表達；（E）陰性對照，（F）彈性蛋白，（G）LOX，和（H）彈性蛋白。（I）培養4周后，支架的宏觀外觀顯示出組織樣質地。（J，K）支架的機械性能；從2周（n=5）至4周（n=3）培養期間，支架的楊氏模量（J）和UTS（K）顯著增加。比例尺=50μm。
圖4.纖維蛋白原基移植物的表征。（A）軋制薄板接枝的宏觀圖像。（B）SEM顯微照片，顯示了電紡纖維蛋白原纖維的排列方向，以及接種細胞在纖維排列方向上的取向（B）。（C）僅薄板纖維蛋白原的TEVG橫截面的SEM顯微照片，其顯示定向纖維的同心層（箭頭表示相鄰的層）。（D）在未補充和TGF-β1補充的TEVG中α-SMA、I型膠原、彈性蛋白和彈性蛋白染色的免疫熒光顯微照片。軋制薄板移植物表現出較差的細胞浸潤和少量的ECM合成。兩組的接種細胞均顯示α-SMA和原彈性蛋白的陽性表達。兩組均顯示陽性的I型膠原蛋白表達，盡管在補充TGF-β1的整個組中更為普遍。兩組中主要在細胞化的薄片表面觀察到彈性蛋白表達。（E）對彈性蛋白合成的快速測定分析表明，在TGF-β1處理的樣品中彈性蛋白含量顯著增加（p=0.027）約30％。（F，G）與隨機取向的管狀TEVG（n=5）相比，添加（n=5）或不添加（n=5）TGF-β1的軋制薄板TEVG的楊氏模量（E）和UTS：TGF-β1補充組顯示出顯著增加的彈性模量和UTS（p<0.001）。比例尺：B=10μm；C=400μm；D=50μm。
圖5.培養4周后，PCL增強的軋制薄板TEVG中的細胞外基質發育。（A）培養4周后PCL增強的軋制薄板TEVG的宏觀圖像。（B）TEVG橫截面的立體光學顯微照片（箭頭：黑色-PCL層，藍色-纖維蛋白膠，紅色-纖維蛋白原層）。（C）薄片表面的SEM顯微照片，顯示纖維蛋白原纖維上的定向血管細胞（箭頭）。（D，E）在生長培養基中（D）或添加TGF-β1（E）的軋制薄板（+PCL）TEVG中通過移植物壁厚度進行細胞化。（F）細胞核取向的定量顯示出高度的細胞局部取向。（G）在整個PCL增強的軋制薄板TEVG中合成的ECM組分的免疫熒光顯微照片。未補充和TGF-β1補充的TEVG均顯示出支架的廣泛基質重塑，如纖連蛋白的大量表達。與I型膠原蛋白染色相比，兩組均顯示出更高程度的III型膠原蛋白染色，其中TGF-β1補充組的更大面積顯示出陽性III型膠原蛋白檢測。與軋制薄板（+PCL+TGFβ1補充）TEVG（分別為1.18±0.05、3.35±1.1 MPa和1773±11.9）進行比較（每組n=3），軋制薄板（+PCL）TEVG的UTS（H）、楊氏模量（I）和計算的爆裂壓力（J）之間沒有顯著性差異（分別為1.14±0.03、2.86±0.45 MPa和1712±38.2 mmHg）。比例尺：B=400μm；C=10μm；D，E=100μm；G=50μm。
圖6.PCL增強的纖維蛋白原TEVG中彈性纖維相關蛋白（EFRP）合成的定性和定量分析。（A）人臍帶動脈、軋制薄板（+PCL）TEVG和軋制薄板（+PCL+TGF-β1補充）TEVG中EFRP和α-SMA表達的免疫熒光顯微照片。TEVGs在兩組中均顯示原彈性蛋白、LOX、原纖維蛋白-1和彈性蛋白的陽性表達，以及4周后接種細胞中α-SMA表達的保留。染色后的TEVG橫截面顯示出環形富EFRP基質的豐富同心帶，兩組均對彈性蛋白進行了廣泛的陽性染色。（B）α-SMA表達、彈性蛋白和β-肌動蛋白的蛋白質印跡比較。（C）對原彈性蛋白表達的定量表明在補充TGF-β1的移植物中表達顯著增加2.01±0.21倍（p＜0.05；n=3）。（D）對α-SMA表達的定量表明在補充TGF-β1的移植物中表達增加了1.73±0.23倍（p＜0.05）。（E）Fastin測定分析顯示，補充TGF-β1的移植物中彈性蛋白含量從0.29±0.012降低至0.17±0.02 g/g（每個培養基組n=3）。比例尺：A=50μm。
