DOI: 10.1039/D0BM00442A
糖尿病傷口仍然是一項嚴峻的臨床挑戰，而當前的療法在降低高致殘率和高發病率方面作用有限。血管生成受損與糖尿病傷口的延遲愈合密切相關，據報道，GLP-1R受體激動劑利拉魯肽（Lira）可以提高內皮細胞的血管生成能力。然而，由于藥物濃度的不可持續性，其應用受到了限制。本研究通過1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS），一種綠色交聯接枝集成方法，制備了聚乳酸-乙醇酸/明膠(PLGA/Gel)納米纖維墊支架，用于皮膚組織工程的利拉魯肽緩釋。利拉魯肽與PLGA/Gel的結合增加了納米纖維墊的孔徑、親水性、彈性和降解性能，這有利于傷口愈合。此外，還評估了該材料對糖尿病傷口愈合、血管形成的影響及其潛在機制。結果表明，PLGA/Gel/Lira顯著提高了糖尿病真皮傷口的愈合效率，其特點是縮短傷口閉合時間、增加血管密度并提高膠原蛋白的沉積和排列。在體外，Lira逆轉了由高葡萄糖（HG）誘導的對內皮細胞增殖、遷移、分化和VEGF分泌的抑制作用。至于潛在機制，Lira特異性降低了miR-29b-3p的水平，靶向AKT/GSK-3β/β-連環蛋白途徑以調節內皮細胞的生物學功能。總之，本研究首次將PLGA/Gel與Lira結合使用，以利用它們的協同作用促進血管生成，這是加速糖尿病創面修復的一種有希望的策略。
圖1.納米纖維氈的SEM圖像和直徑分布。（A）通過SEM獲取PLGA、PLGA/凝膠和PLG/凝膠/Lira納米纖維墊的形態。比例尺=60μm（×1000）和10μm（×6000）。（B）由PLGA、PLGA/凝膠和PLGA/凝膠/Lira組成的納米纖維墊的直徑分布。
圖2.納米纖維墊的親水性測試和FTIR分析。（A）通過水接觸角評估納米纖維墊的親水性。（B）PLGA、PLGA/Gel和PLGA/Gel/Lira在900-4000波數范圍和1000-2000波數范圍的FTIR光譜曲線。
圖3.納米纖維墊的機械性能。由干燥狀態下的PLGA、PLGA/Gel和PLGA/Gel/Lira組成的納米纖維氈的徑向應力-應變曲線、楊氏模量、拉伸強度和屈服伸長率。數據表示為平均值±SEM（n=3）。*P＜0.05
圖4.納米纖維墊的降解和緩釋性能。（A）將由PLGA、PLGA/Gel和PLGA/Gel/Lira組成的納米纖維墊浸入PBS中的剩余質量。（B）PLGA/Gel/Lira納米纖維墊中Lira的體外釋放。
圖5.Lira加速了體內傷口愈合。（A）STZ處理的大鼠和傷口全層缺損的手術步驟以及PLGA/Gel、PLGA/Gel/0.5mg Lira和PLGA/Gel/1.0mg Lira納米纖維墊的植入示意圖。（B）在手術后第0、3、5、7和14天全厚度皮膚缺損的代表性圖像。比例尺=10 mm。（C）通過傷口的攝影圖像量化的傷口閉合率。（D）H＆E染色的代表性圖像，以評估第7天和第14天的新上皮總長度。比例尺=2 mm。（E）通過H＆E染色定量傷口長度速率。（F）手術后第7天和第14天的Masson三色染色。比例尺=400μm（×100）和100μm（×400）。數據表示為平均值±SEM（n=3）。*P＜0.05
圖6.Lira改善了糖尿病大鼠的血管生成受損。（A）通過Microfil灌注評估對照組、PLGA/Gel、PLGA/Gel/0.5mg Lira和PLGA/Gel/1.0mg Lira納米纖維墊組中的新血管。比例尺=2 mm。（B）在第7天和第14天通過Microfil灌注對新血管區域和每個視野的新血管數量進行定量。（C）第7天和第14天用CD31和CD31/α-SMA染色血管的免疫組織化學和免疫熒光評估（紅色箭頭代表血管）。比例尺=100μm。（D）在第7天和第14天每個視野的血管數量的量化。數據表示為平均值±SEM（n=3）。*P＜0.05
圖7.Lira通過HUVEC促進增殖、遷移、管形成和VEGF分泌。（A）在第1、3和7天用不同處理孵育的HUVEC的增殖。（B）HUVEC的遷移和管形成的代表性圖像。比例尺=100μm。（C）HUVEC中細胞遷移的定量。（D）HUVEC中管形成的定量。（E）
通過Elisa評估由HUVEC釋放的細胞上清液的VEGF濃度。（F）HUVEC的免疫熒光評估VEGF分泌的能力。細胞骨架、細胞核和VEGF分別染成紅色、藍色和綠色。比例尺=200μm。數據表示為平均值±SEM（n=3-6）。*P＜0.05。
圖8.過表達miR-29b-3p在體外抑制了Lira促血管生成。（A）LG、HG和HG+Lira處理后HUVEC中miRNA的相對表達。（B）用HG+陰性對照模擬物（ncm），HG+Lira+ncm和HG+Lira+miR-29b-3p模擬物（Lira+29bm）處理的HUVEC中miR-29b-3p的相對表達。（C）與HG+ncm、HG+Lira+ncm和HG+Lira+29bm共孵育的HUVEC的增殖。（D-F）代表性圖像以及管形成和遷移的量化。比例尺=200μm。（G）用HG+ncm、HG+Lira+ncm和HG+Lira+29bm處理的HUVEC細胞上清液的VEGF濃度。數據表示為平均值±SEM（n=3-6）。*P＜0.05
圖9.AKT/GSK-3β/β-catenin途徑在HUVEC中miR-29b-3p介導的Lira促血管生成能力方面起著重要作用。（A）通過TargetScan、miRanda miRTarbase和PicTar數據庫預測MiR-29b-3p目標。（B）通過交叉miR-29b-3p的可能靶標和與內皮細胞增殖和遷移有關的GO來調節靶標篩選的內皮細胞。（C）通過熒光素酶報告直接抑制miR-29b-3p對AKT的作用。（D）用LG、HG、HG+50nM Lira、HG+50nM Lira+XAV-939（HG+Lira+XAV）和HG+50nM Lira+LY294002（HG+Lira+LY）處理，通過免疫印跡法檢測HUVEC的GSK-3β和AKT磷酸化水平以及β-連環蛋白的相對表達水平。（E）在第1、3和7天，HUVEC的增殖。（F-H）HUVEC的遷移和管形成的圖像和定量分析。比例尺=200μm。（F）用LG、HG、HG+Lira、HG+Lira+XAV和HG+Lira+LY處理的HUVEC細胞上清液的VEGF濃度。數據表示為平均值±SEM（n=3-6）。*P＜0.05。
