Appl. Surf. Sci.：雙重生長因子在羥基磷灰石涂層納米纖維上的表面功能化及其生物應用

DOI:10.1016/j.apsusc.2020.146311

為了改善骨骼生長、模仿天然細胞外基質持續釋放多重生長因子的功能，采用靜電紡絲法制備了多孔明膠納米纖維支架，使用模擬體液溶液涂覆羥基磷灰石，并用抗生物素蛋白進行表面功能化以促進與生物素化生長因子的結合，即骨形態發生蛋白2（BMP-2）和成纖維細胞生長因子2（FGF-2）的比例不同。使用掃描電子顯微鏡進行結構表征，并進行傅立葉變換紅外光譜和鈣測定以評估鈣的組成。免疫染色技術證實了多重生長因子的結合。使用定量聚合酶鏈反應分析研究了兩種生長因子和羥基磷灰石對成骨細胞分化的影響。通過控制FGF-2/BMP-2比率，多重生長因子成功地綴合到功能化表面上。因子釋放曲線與物理吸附曲線的比較表明，抗生物素蛋白-生物素結合對于持續釋放更有效。骨再生通過多重生長因子傳遞與羥基磷灰石納米纖維涂層之間的協同作用而得以增強，成骨基因標志物的表達增加證實了這一點。因此，納米纖維為骨組織工程提供了一種有希望的具有多重生長因子控釋的骨傳導性支架材料。

圖1.用于骨組織再生的FGF-2/BMP-2-固定羥基磷灰石/明膠納米纖維支架的制備過程示意圖。

圖2.（a，b）明膠納米纖維的SEM圖像；通過cSBF處理的G，（c，d）羥基磷灰石/明膠納米纖維；經mSBF處理的cH-G（e，f）；mH-G方法，每種情況下鈣含量的圖形量化（右）。****=P<0.0001。圖（b，d，f）高倍率SEM圖像。a，c，e中的比例尺代表20 μm，b，d，f中的比例尺代表10 μm。

圖3.用cSBF和mSBF溶液處理過的明膠納米纖維和羥基磷灰石/明膠納米纖維的溶脹度（a）和降解率（b-c）圖。

圖4.含生長因子的免疫染色的熒光顯微鏡圖像。（a）和（c）不含任何生長因子的純明膠納米纖維。（b）和（d）FGF-2和BMP-2以1:1比例固定的納米纖維。納米纖維上的FGF-2用紅色（a）和（b）表示，納米纖維上的BMP-2用綠色（c）和（d）表示。放大倍數為10倍。

圖5.用FGF-2:BMP-2（1:1比值）標記明膠納米纖維抗體的FGF-2和BMP-2的熒光強度表示為G11，用cSBF和mSBF方法，FGF-2:BMP-2（1:1比值）標記的羥基磷灰石/明膠納米纖維的熒光強度分別表示為cH-G11和mH-G11。進行統計分析以與對照組（G）比較。（**=P<0.01，*=P<0.05）。

圖6.細胞培養1、3、5和7天（以2,000個細胞/孔播種）后，明膠納米纖維上hASC的CCK-8結果。所有條件均使用納米纖維（對照組為純納米纖維）進行。 （a）按羥基磷灰石的材料和結構比較。（b）按生長因子比較不同種類的結構。進行統計分析以與對照組比較（G代表（a），FGF代表（b））。（*=P<0.01，***=P<0.001，****=P<0.0001）。

圖7.hASC培養物在明膠納米纖維（G）和羥基磷灰石/明膠納米纖維（cH-G和mH-G）上的成骨基因表達。進行統計分析以與對照組（G）比較。（*=P<0.05，**=P<0.001）。

圖8.在生長因子固定的不同條件下（FGF-2:BMP-2=1:0、1:1和0:1分別顯示為cH-G10、cH-G11和cH-G01），hASCs在羥基磷灰石/明膠納米纖維（cH-G）上的RunX2、COL1α1和OCN基因表達。進行統計分析以與對照組（BMP）比較。（***= P<0.001，****=P<0.0001）。

圖9.在生長因子固定的不同條件下（FGF-2:BMP-2=1:0、1:1和0:1分別顯示為mH-G10、mH-G11和mH-G01），hASCs在羥基磷灰石/明膠納米纖維（mH-G）上的RunX2、COL1α1和OCN基因表達。進行統計分析以與對照組（BMP）比較。 （***=P<0.001，****=P<0.0001）。

圖10.在有無生長因子固定的不同條件下（FGF-2:BMP-2=1:0、1:1和0:1），hASCs在明膠納米纖維（G）和羥基磷灰石/明膠納米纖維（mH-G，cH-G）上的堿性磷酸酶活性。進行統計分析以與對照組（G）進行比較。所有樣品條件下的活性均顯著高于對照組，P<0.05。

圖S1.明膠納米纖維的尺寸分布（直徑）：（a）明膠納米纖維，和（b，c）用cSBF和mSBF溶液處理過的羥基磷灰石/明膠納米纖維。

圖S2.（a）明膠納米纖維和（b，c）羥基磷灰石/明膠納米纖維，（b）cH-G和（c）mH-G的FT-IR光譜。

圖S3.在明膠納米纖維上培養的人脂肪干細胞的活/死分析的熒光圖像：（a）呈現培養皿中的細胞，（b）呈現G，（c）呈現cH-G，（d）呈現mH-G。比例尺：200 μm。

圖S4.在明膠納米纖維上培養的人脂肪干細胞的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚/若丹明染色的熒光圖像：（a）呈現培養皿中的細胞，（b）呈現G，（c）呈現cH-G，以及（d）呈現mH-G。比例尺：200 μm。

圖S5.在純、cH-G和mH-G條件下，在明膠納米纖維上培養的人脂肪干細胞的活/死分析熒光圖像。比例尺：200 μm。

圖S6.細胞培養7天后（明膠以2,000個細胞/孔播種），明膠納米纖維上的hASCs的CCK-8結果。顯示了含生長因子（FGF-2和BMP-2比例為1:1）的納米纖維與不含生長因子的納米纖維的比較。使用無生長因子的樣品作為對照組進行統計分析。（**=P<0.01，*=P<0.05）。

圖S7.從明膠納米纖維和羥基磷灰石/明膠納米纖維中累積釋放FGF-2生長因子。 GA表示具有吸附的生長因子的純納米纖維。G、cH-G和mH-G表示純納米纖維，通過cSBF方法生產的羥基磷灰石/明膠納米纖維，以及用mSBF法生產的羥基磷灰石/明膠納米纖維，其中生長因子用抗生物素蛋白-生物素復合物結合。縮寫后的數字表示FGF-2和BMP-2的含量，單位為ng ml-1。假定生長因子負載量在100%結合時有效。

圖S8.用不同濃度的生長因子標記的抗體的熒光顯微鏡圖像。（a）和（e）沒有任何生長因子的純明膠納米纖維。FGF-2與BMP-2的比例為1:0（b，f）、1:1（c，g）和0:1（d，h）。納米纖維上的FGF-2用紅色（a-d）表示，納米纖維上的BMP-2用綠色（e-h）表示。放大倍數為10倍。