DOI:10.1016/j.biomaterials.2020.120034
適當的巨噬細胞對植入生物材料的響應對于組織愈合的成功至關重要。在這項工作中，研究了電紡生物材料和外部機械載荷的內在拓撲線索如何協同引導巨噬細胞活化以及巨噬細胞-肌腱成纖維細胞的串擾效應。在機械加載和未加載的條件下，使用定向或隨機取向的聚己內酯納米纖維基質進行了一系列的體外和體內實驗。在所有實驗中，無序的生物材料纖維形態足以促進巨噬細胞、肌腱成纖維細胞和肌腱組織中的促炎信號。研究發現外部機械負荷通過在體內和體外減少促炎性標志物來強烈調節該標志的特征。研究者觀察到，與肌腱成纖維細胞相比，巨噬細胞通常顯示出對生物物理線索的更強響應，在機械共培養模型中觀察到這些細胞類型之間的串擾效應尤為顯著。總的來說，這些研究數據表明巨噬細胞在肌腱修復中作為機械感覺細胞發揮著潛在的重要作用，并提供了對合理的生物材料設計如何治療性調節生物學反應的見解，這些設計可以解決募集細胞的生物力學生態位。
圖1：在體外，隨機取向的基底促使巨噬細胞向增強的促炎表型極化。（A）SEM圖像顯示附著在隨機（左圖）和定向（右圖）PCL基質上的巨噬細胞之間的形態學差異，平均纖維直徑為700 nm，在定向基底上有細長的細胞。（B）在隨機（棋盤格）和定向（白盒）基底上培養的M0巨噬細胞中，CCR7（M1樣）和MRC1（M2樣）的基因表達水平相似。在隨機取向的纖維上培養的細胞中，檢測到IL1B的表達明顯增加，而TNF和TGFB1的表達水平保持不變。（C）流式細胞儀分析顯示，如果在隨機基底上培養，則M0巨噬細胞向促炎（CCR7+）表型極化。通過測量在隨機排列的PCL納米纖維基底上培養的M0巨噬細胞中CCR7（紅色點）和MRC1（綠色三角形）陽性細胞的百分比來進行評估。（D）暴露于不同地形線索的巨噬細胞中的細胞因子分泌顯示出在隨機基底上培養的細胞中促炎性細胞因子TNF的蛋白質釋放顯著增加。數據表示為n=6（B）、5（C）、3（D）的中位數，且具有四分位數范圍，并且當*P≤0.05時，表明數據具有顯著性差異。通過雙向方差分析與Tukey的多重比較測試進行統計學分析，以評估兩組之間基因表達水平的統計學差異。此外，進行了帶有Dunn事后檢驗的KruskalWallis非參數方差分析，將每種治療方法與其對應的對照組（TCP上的M0）進行比較（C，D）（*P≤0.05，***P≤0.001，****）P≤0.0001）。比例尺代表50μm（放大倍數）。
圖2：動態加載M0巨噬細胞在體外誘導向促炎性M1樣表型的極化轉變。（A，B）機械負荷會上調M0巨噬細胞中CCR7（M1標記）的表達。由于動態負載，CCR7顯著增加，而MRC1基因表達保持不變（n=9）。（C）與未負載的對照組（隨機基底上的M0）相比，CCR7陽性細胞的百分比表明動態負載細胞群中的極化移位（n=6）。（D-F）另外，與靜態負載條件相比，動態負載下測定炎性細胞因子IL1B、TNF和TGFB1的基因表達水平。結果通過其中位數歸一化為隨機無負載基質上的M0巨噬細胞（n=9）。使用Kruskal Wallis非參數ANOVA與Dunn事后檢驗進行統計學分析，比較每種治療方法及其相應的對照組（隨機或對齊的PCL上的M0）進行比較（*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001）。
圖3：體外巨噬細胞條件培養基（CM）刺激的hTFs的免疫反應。（A）使用多重ELISA在上清液中測量機械調節的巨噬細胞中的細胞因子分泌。在機械負載（1%和7%菌株）和未負載巨噬細胞（n=6）的上清液中測量IL-6、TNF、IL1β和IFN-γ的水平。（B） 將hTFs接種于經促炎性巨噬細胞條件培養基（CM-M1）刺激的F-actin（紅色）和NF-κB-p65（綠色）染色的定向基質上（虛線表示細胞核的位置）。（C） 對p65的免疫染色顯示，動態負載巨噬細胞受CM刺激的hTFs中核p65顯著增加。在隨機基底上培養的未負載M0巨噬細胞條件的培養基作為對照組（n=4）。（D）基因表達分析揭示了機械負載巨噬細胞受CM刺激的hTFs中MMP1的較低表達。在受CM刺激的hTF中，肌腱基因表達和成纖維細胞活化的標記無顯著變化。此外，在暴露于機械負載巨噬細胞培養基的hTFs中，發現炎性細胞因子TNF和IL1B的表達水平顯著降低（n=6）。使用Kruskal Wallis非參數ANOVA和Dunn事后測試進行分析，比較每種治療方法及其相應的對照組（未負載M0的CM）（*P≤0.05，**P≤0.001）。比例尺代表20μm。
圖4：機械負荷可防止IL1B在體外激活NFκB。（A） 核長寬比的量化表明，隨著負荷的增加，核形狀的延伸率顯著增加，在定向基底（白盒）上培養的細胞中標記更明顯（n=3）。（B）hTFs的動態負載導致核p65的存在增加。這種效應在隨機接種的細胞（棋盤格）上比在定向（白盒）基質（n=6）上更明顯。（C） 機械刺激后用IL1B進行促炎性刺激可顯著減少p65亞單位易位（n=6）。采用Kruskal-Wallis非參數ANOVA和Dunn事后測試進行統計學分析，比較每種治療方法及其相應的對照組（PCL上的M0隨機或對齊，無負荷）（P≤0.05，**P≤0.01，**P≤0.001）。
圖5：M0和hTF的直接共培養可增加hTF中核NFκB-p65的易位。（A）在定向PCL基底上培養的M0巨噬細胞和hTF的免疫熒光染色，對F-肌動蛋白（紅色）、DNA（藍色）和NFκB-p65（綠色）進行染色。（B）對hTF中NFκB-p65的核轉運進行定量分析顯示，與M0巨噬細胞共培養時，其水平顯著增加。然而，在機械刺激條件下，核p65含量較低（n=5）。（C）使用CD14和CD90染色，通過流式細胞術檢測細胞群。CD14陽性和CD90陰性細胞表示巨噬細胞，而CD90陽性和CD14陰性細胞表示肌腱成纖維細胞。（D）CD14+/CD90-細胞極化標記物CCR7+（M1型標記）和MRC1+（M2型標記）的進一步門控表明，如果在直接共培養中暴露于7%動態負荷下，則有向抗炎巨噬細胞極化的趨勢。MRC1+/CCR7+細胞之間的比例顯示，在動態負載的共培養條件下（n=6），MRC1+陽性細胞的比例顯著增加。具體而言，對于M0單培養，CCR7+細胞的百分比為4.5%，對于M0+hTF共培養，為4.32%，對于動態負載共培養，為4.745%。對于MRC1+細胞，測定了2.45%為單培養，2.14%為共培養以及4.7%為動態負載共培養。使用KruskalWallis非參數ANOVA與Dunn事后檢驗進行統計分析，比較每種治療方法及其相應的對照組（分別為hTF，未負載或M0在PCL上對齊，未負載）（*P≤0.05，**P≤0.01）。比例尺代表20μm。
圖6：PCL支架與體內不同纖維組織的組織整合。（A，B）植入大鼠跟腱后7天，隨機取向（上圖）和定向（下圖）支架的抗CD68染色。核染色（DAPI，合并，右圖）顯示了兩種構建體中都有大量宿主細胞，而抗CD68染色（粉紅色，左圖）定性表明在隨機取向的樣品中免疫細胞覆蓋了更多/更大的區域。A和B中的黃色虛線（星號）表示支架在組織中的位置。比例尺代表100 μm。（C）每單位面積細胞數量的半定量分析表明，隨機取向的纖維支架周圍和隨機染色的免疫細胞數量變化很大，與體外觀察結果一致，機械卸載和纖維解離促進了促炎信號。使用Kruskal Wallis非參數ANOVA和Dunn的多重比較檢驗進行統計分析，以評估兩組之間的統計差異（p=0.333）。
圖7：促炎細胞因子分泌對體內電紡纖維排列和肌肉力量敏感。放置在未治療動物的肌腱中的隨機取向（A）和定向（B）支架（虛線之間，星號）的代表性圖像，并用IL-1?抗體染色（IL-1?-左圖中的紅色信號，右圖為IL-1?信號、DIC和核染色的合并）。（C）組織切片上IL-1?表達的半定量分析。宿主細胞植入定向支架后，IL-1的分泌明顯增加。采用Mann-Whitney試驗進行統計分析，分別比較動態負載（未處理）和未負載（肉毒桿菌處理組）組的定向支架和隨機支架（*P≤0.05）。比例尺代表100μm。
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