DOI:10.1021/acsami.9b22596
阻礙體外骨關節炎研究轉化為臨床疾病緩解療法的一個主要限制因素是軟骨細胞在標準單層條件下會迅速擴散和去分化。目前在培養過程中保持軟骨細胞圓形形態的策略要么非自然地限制了粘附，要么將軟骨細胞置于過硬的機械環境中，或在許多應用中不可行。為了解決當前技術的局限性，研究者開發了一種獨特的復合薄膜細胞培養平臺CellWell，用于模擬關節軟骨，該平臺利用微圖案化的半球形孔，精確地測量單個細胞（直徑12-18μm）的大小，促進生理上的球形軟骨細胞形態，同時保持與標準細胞培養和分析技術的兼容性。采用電紡聚乙烯醇（PVA）納米纖維包埋15μm厚的5%瓊脂糖纖維構建CellWells。透射電子顯微鏡（TEM）顯示PVA納米纖維的平均直徑為60.9±24 nm，與觀察到的人類腳踝II型膠原纖維的平均直徑53.8±29 nm非常吻合。利用AFM納米壓痕技術，在15μm/s壓痕下，CellWells的壓縮模量為158±0.60 kPa，與天然細胞周基質的硬度值非常吻合。將取自踝關節軟骨的原代人類關節軟骨細胞接種到CellWells中，并于24小時進行評估。軟骨細胞在CellWells中保持其圓形形態（平均長寬比為0.87±0.1，相對于三維（3D）對照[0.86±0.1]）比在標準條件下（0.65±0.3）接種的效果更為有效，平均存活率大于85%。CellWell的設計，在具有生理硬度的薄膜基質中存在開放的半球形孔，將二維（2D）培養系統的實際優勢與三維系統的生理優勢結合在一起。通過其易用性和維持軟骨細胞生理形態的能力，期望CellWell將提高未來利用該培養平臺進行研究的臨床轉化性。
圖1.軟骨細胞形態影響內部結構。使用標準2D細胞培養技術將小鼠股骨頭髖關節外植體（A）和原代人類關節軟骨細胞（B）（C）鍍在纖維粘連蛋白（FN）涂層的蓋玻片上，用4%多聚甲醛固定，并用ActinRed 555 Ready探針試劑染色 （ThermoFisher），在GE DeltaScan OMX SR顯微鏡上使用3D結構照明顯微鏡（3D-SIM）以超高分辨率成像。 顯示了體積圖像堆棧的最大強度投影。請注意，在（A）的側視圖中，組織的渾濁阻止了外植體圖像中除最表面結構以外的所有結構的成像，這是自然組織和3D細胞培養物成像中的常見問題。比例尺為2μm，適用于頂部和側面投影。
圖2.CellWell設計示意圖。（A）光掩模設計的代表性部分。單位為μm。（B）沿（A）中的虛線的CellWell的截面圖。
圖3.AFM實驗設計示意圖。（A）納米壓痕階段。（B）應力松弛階段。
圖4.軟骨細胞直徑分布。（A）原代人類關節軟骨細胞在懸浮液中的平均直徑為14.6±2.1μm（SD），每個供體的平均直徑約為11至19μm。（B）細胞計數屏幕顯示了一個具有代表性的單供體軟骨細胞直徑分布。
圖5.微圖案化孔與軟骨細胞直徑匹配。（A）用于創建CellWells的光刻圖案的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。（B）CellWell的相襯圖像，具有三種尺寸的孔，孔尺寸精確到適合單個關節軟骨細胞的大小；比例尺10μm。（C）單個孔的光學輪廓測定橫截面輪廓（平均值±標準偏差，n=10個孔）。（D）CellWell的宏觀外觀；比例尺5 mm。
圖6.CellWell瓊脂糖和踝關節軟骨的機械特性。（A）瓊脂糖CellWells的平均納米壓痕曲線。（B）瓊脂糖CellWells和關節軟骨的平均應力松弛。（C）關節軟骨的平均納米壓痕曲線。（D）不同應變率下瓊脂糖CellWells上的平均納米壓痕。
圖7.用視頻光譜比較儀測量CellWells的透光率，證實了CellWells的透光性。
圖8.FTIR光譜證實了PCM蛋白在CellWells上的成功涂覆。
圖9.電紡PVA納米纖維的直徑分布代表了踝關節軟骨中的II型膠原纖維。 （A）交聯后的PVA納米纖維和（B）從腳踝提取的II型膠原纖維的TEM圖像；比例尺1μm。（C）交聯的PVA納米纖維的分布，以概括用于分離軟骨細胞培養的CellWell關節軟骨模型中關節軟骨細胞外基質II型膠原纖維的性質。纖維測量值是從n=3個獨立樣本中獲得的，各個測量值均顯示在圖表上。
圖10.軟骨細胞的活力在CellWell中得以維持。使用標準倒置熒光顯微鏡在24 h觀察到軟骨細胞活力為85.6±10.5%（SD）。細胞可滲透NucBlue染色所有細胞核（以綠色顯示），而細胞不滲透NucGreen僅染色膜被破壞的（死）細胞的細胞核（以品紅色顯示；死細胞在重疊圖像中顯示為白色）。比例尺50μm。
圖11.CellWells促進生理性軟骨細胞形態的維持。（A）在24小時使用不同平臺接種的軟骨細胞的相襯圖像顯示在n=3個供體的每個平臺上接種的軟骨細胞的長寬比分布。在3D瓊脂糖和CellWell軟骨細胞形態之間未觀察到差異，這表明CellWell維持了生理形態，而所有其他樣品在Kruskal-Wallis和Dunn的事后多重比較檢驗的基礎上均存在顯著性差異（p≤0.0002）。比例尺50μm。
圖12.聚多巴胺功能化可促進CellWell中軟骨細胞形態維持28天。（A）在CellWell中接種4周的軟骨細胞的相襯圖像顯示出典型球形形態的穩固維持；藍色箭頭：軟骨細胞；紅色箭頭：PDA聚集的大小顆粒；比例尺50μm。（B）PDA功能化CellWell的宏觀外觀顯示瓊脂糖明顯變黑。（C）在4周的時間內進行的寬高比測量（平均值±標準偏差，n=150個細胞）顯示CellWell能夠長期保持球體形態（基于Kruskal-Wallis測試和Dunn的多重比較事后分析，相對于每個時間點的二維蓋玻片，p＜0.0001）。
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