含雙功能肽的纖維素膜用作高級傷口敷料

DOI: 10.1002/adhm.201901850

漸進的抗生素耐藥性是醫療衛生領域的一項嚴峻挑戰，增加了皮膚傷口治療的難度，因此迫切需要使用替代抗生素的抗菌創面敷料。越來越多的研究指出纖維素膜可作為傷口敷料，只是還需要進一步的功能化步驟。在本研究中，設計了一種結合抗菌肽（AMP）和纖維素結合肽（CBP）的雙功能肽。AMPs通過多種作用方式影響細菌，從而降低選擇抗生素耐藥性的進化壓力。雙功能肽已成功地固定在細菌來源的纖維素膜或植物來源的纖維素的電紡纖維上，并嚴格控制肽濃度（0.2±0.1至4.6±1.6μg mm-2）。利用這一方法，開發了對金黃色葡萄球菌（log4減少）和銅綠假單胞菌（log1減少）具有抗菌活性的新材料。此外，膜在人成纖維細胞培養中具有細胞相容性。此外，還設計了一種細胞粘附劑CBP-RGD肽并將其固定在膜上，與原始纖維素相比，可使細胞擴散增加2.2倍。通用概念為不同來源和結構的纖維素膜的功能化提供了一個工具箱，并在肽方面有廣泛的選擇。緩沖鹽溶液中的功能化避免了進一步的純化步驟，從而可在傷口敷料領域之外進行轉化研究和多種應用。

圖1.不同纖維素來源和特性的膜的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。a）醋酸纖維素/聚氨酯共混物（CAPU）的電紡纖維，以及b）纖維素/聚氨酯（CPU）脫乙酰化的電紡纖維。脫乙酰之前和之后獲得的SEM圖像均未顯示纖維形態的任何差異。電紡纖維在亞微米范圍內，平均直徑為0.80±0.41 μm（n=200）。c）細菌纖維素（BC）顯示的纖維平均直徑為69±26 nm（n=150）。d）在所有膜上，測量水在空氣中的接觸角。數據表示為每個膜n=3次測量的平均值±標準偏差。在CPU膜上觀察到完全潤濕。

圖2.用X射線光譜學（XPS）表征基底的化學表面成分。a）醋酸纖維素和脫乙酰纖維素的化學結構。b）細菌纖維素（BC）、醋酸纖維素（CA）、聚氨酯（PU）、5:95醋酸纖維素:聚氨酯（5％CAPU）、10:90醋酸纖維素:聚氨酯（10％CAPU）和脫去乙酰基的10:90纖維素:聚氨酯（CPU）的光譜圖。插圖：在400 eV處放大。 PUR和5％CAPU中存在氮，這是通過400 eV處的峰來體現的。c）i）BC、ii）10％CAPU和iii）脫乙酰化的10％CAPU的C 1s化學環境的高分辨光譜以及C-C、C-O、O-C-O和O-C=O的對應擬合。O-C=O峰用于監測電紡膜的脫乙酰作用。d）乙酰基的定量。在Na/MetOH中脫乙酰3小時后，觀察到O-C=O的減少。數據表示為n=7（CAPU）或n=5（CPU）單個膜的平均值±標準偏差。在非參數Mann-Whitney檢驗中評估統計學顯著性，*p<0.05。

圖3.a）細菌纖維素膜（BC）上肽的定量。為了控制纖維素膜上表觀的最終肽濃度，評估了不同的固定條件。選擇了在其最終肽濃度上有顯著差異的四種條件，以在細菌和哺乳動物細胞培養物中進行體外評估（紅色標記）。數據表示為每種條件下n=4個膜的平均值±標準偏差。b）根據固定在細菌纖維素（BC）以及c）電紡纖維素：聚氨酯膜（CPU）上的條件，對纖維素基質上肽濃度的定量。在類似的固定參數下，可以將更多量的肽束縛到電紡膜上。繪制了本研究中使用的所有單個膜。水平線代表平均值。在非參數Kruskal-Wallis檢驗中評估統計學顯著性，然后在Mann-Whitney檢驗中進行成對比較。除非用n.s.另作說明，否則（b）或（c）中條件之間的平均值存在顯著性差異，p<0.05。

圖4.AMP–CBP–FAM功能化膜的抗菌活性。通過再生試驗確定響應于肽濃度的菌落形成單位（CFU）。在x軸上顯示測得用于細菌培養的實際膜的平均肽濃度。a）金黃色葡萄球菌；條件之間的非顯著性差異用n.s突出顯示。所有其他條件之間顯示統計學上的顯著性差異。b）銅綠假單胞菌；與對照組相比，*p<0.05。在（a）和（b）中，顯示了單個數據點，水平線表示平均值，黃色背景突出顯示了沒有固定肽的對照組。在非參數Kruskal-Wallis檢驗中評估統計學顯著性，然后在Mann-Whitney檢驗中進行成對比較。平均值之間存在顯著性差異，p<0.05。N=3個單獨實驗，每個實驗中n=3-5個技術重復。

圖5.功能化膜的體外細胞毒性。a）細菌纖維素（BC），和b）電紡纖維素：聚氨酯膜（CPU）。將人皮膚成纖維細胞接種在不同肽濃度的功能化膜上，并在1或3天后（d1，d3）評估其細胞代謝活性。箱形圖表示第25和75個百分位，須表示最小值和最大值，黑色正方形表示異常值，平均值顯示為水平線。在x軸上顯示所用膜測得的平均肽濃度。在第1天顯示相對于非功能化膜的值（對照組，0，黃色背景）。與d1對照組相比，*p<0.05，與d3對照組相比，＃p<0.05。 N=3個獨立實驗，其中n=3個技術重復。在非參數Kruskal-Wallis檢驗中評估統計顯著性，然后在Mann-Whitney檢驗中進行成對比較。

圖6.在AMP-CBP-FAM功能化膜上培養的NHDF的CLSM圖像。在成像之前將NHDF培養3天。顯示了兩種不同功能化條件的圖像：低肽濃度（在BC或CPU上分別為0.2±0.1或0.3±0.2 μg mL-1）或高肽濃度（在BC或CPU上為1.1±0.4或4.6±1.5 μg mL-1） 。不含任何肽的原始膜用作對照。左行：3×3展開圖，顯示各個膜的概覽；右行：代表點的20倍放大。對NHDF進行肌動蛋白（紅色）和細胞核（藍色）染色。

圖7.用CBP-RGD雙功能肽對BC膜進行功能化。NHDF在RGD功能化或無肽對照膜上培養a）1天（d1）或b）2天（d2）。與原始BC膜上的NHDF（對照）相比，RGD功能化膜上的NHDF更大且分布更廣。c）用alamarBlue評估細胞代謝活性。在第1天將值標準化為BC。與原始膜相比，在RGD功能化的BC膜上觀察到細胞的細胞代謝活性增加。d）基于CLSM圖像定量細胞擴散面積，并標準化為細胞計數（每個細胞的面積）。與對照組相比，在RGD功能化的膜上，細胞擴散明顯更大。N=3個獨立實驗，其中n=3個技術重復。基于每種條件下的n=8個代表性圖像來量化細胞擴散。在非參數Kruskal-Wallis檢驗中評估統計顯著性，然后在Mann-Whitney檢驗中進行成對比較，*p<0.05。