局部遞送雙重MicroRNAs的三層電紡移植物用于血管再生

DOI:10.1021/acsami.9b19452

全球范圍內與心血管疾病相關的問題日益增多，這導致了對人造血管移植物的巨大需求。對于小口徑人工血管來說，快速內皮化、抑制內膜增生、防止鈣化是保持通暢的關鍵。為了調節血管再生，本文中，研究者開發了一種生物活性的三層組織工程化血管移植物，將microRNA-126和microRNA-145分別包封在纖維內層和中間層。體外細胞活性表明，通過快速釋放microRNA-126和緩釋microRNA-145，三層電紡膜在增強血管內皮細胞的生長和細胞內一氧化氮生成、調節血管平滑肌細胞（SMCs）的表型以及抑制鈣沉積方面具有顯著的生物學優勢。對大鼠腹主動脈介入模型進行體內植入的組織學和免疫熒光分析表明，雙microRNA負載的三層電紡絲移植物對加速內皮化、促進收縮平滑肌細胞再生和促使正常細胞外基質形成具有積極作用。同時，三層血管移植物中microRNA-126和microRNA-145的局部生物活性可能通過促進巨噬細胞向抗炎性M2表型的轉化來調節炎癥并抑制鈣化。這些發現表明，局部遞送雙重microRNAs的三層電紡移植物可以用作替代人工小口徑血管的生物活性替代物。

圖1.（A）通過連續三步電紡將miR-126和miR-145分別包埋在纖維內層和中間層的三層血管移植物的示意圖。（B）血管移植物中三層的外觀、插圖和SEM圖像。（C）截面移植物和電紡膜表面的SEM圖像以及三層移植物每層中的電紡纖維的CLSM圖像。負載在電紡纖維中的FAM-NC隨機分布在內層和中間層。

圖2.（A）三層電紡膜中兩種miRNAs的體外釋放曲線。（B）釋放35天和56天前后三層樣品內層的掃描電鏡圖像。黃色箭頭表示斷裂或彎曲的纖維。

圖3.三層電紡膜局部遞送miR-126和miR-145對ECs增殖和NO釋放的影響。（A）在不同樣品上培養6天后，CD31-免疫熒光染色的ECs的CLSM圖像。（B）第3天使用DAF-FM探針在不同樣品上培養的ECs中探測細胞內NO釋放的熒光圖像。（C）EC增殖的CCK-8值。（D）DAF-FM熒光強度的定量顯示內皮NO釋放。B/B/PCL上培養的ECs中DAF-FM熒光強度為100％。（E）在不同的三層電紡膜上培養的ECs釋放到培養基中的NO量。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

圖4.三層電紡膜局部遞送miR-126和miR-145對SMC行為的影響。（A）在不同樣品上培養5天后，α-SMA-免疫熒光染色的SMCs的CLSM圖像。（B）光學顯微鏡圖像顯示第8天茜素紅S染色的SMC鈣化的抑制作用。（C）SMC增殖的CCK-8值。（D）使用QuantiChrom鈣測定試劑盒對SMCs中的鈣沉積進行定量，并通過蛋白質濃度標準化。（E）培養5天后通過western印跡測定KLF4、心肌素和MYH蛋白的表達水平，（F）用β-肌動蛋白標準化定量。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

圖5.體內植入4周后對三層移植物的評估。（A）使用彩色多普勒超聲成像系統測試的不同移植物的通暢性，顯示出移植物中的血流。箭頭指示血流（黃色）和縫合部位（藍色）。（B）在立體顯微鏡下植入的移植物的大體視圖和（C）腔表面。B/B/PCL移植物內腔中的紅色箭頭表示肉眼可見的血栓。

圖6.植入4周后三層移植物的內皮化。（A）CD31和eNOS標記ECs呈紅色。＃移植物管腔位置。（B）用CD31染色對移植物的半縱向部分進行內皮覆蓋。細胞核用DAPI（藍色）復染。綠色箭頭表示縫合部位，綠色虛線表示再生的內皮。（C）基于（B）中的CD31染色圖像計算的內皮化率。（D）血管移植物腔表面的SEM圖像。***p<0.001（n=3）。

圖7.植入4周和12周后，不同的三層血管移植物中收縮性SMCs的再生。（A）通過α-SMA抗體和MYH抗體染色檢測的SMCs。所有免疫熒光圖像均用DAPI（藍色）對細胞核染色。＃移植物管腔位置。（B）植入4周后，在植入的移植物中，α-SMA陽性和（H）MYH陽性SMCs的百分比。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

圖8.免疫熒光圖像（A，B）和熒光標記的巨噬細胞百分比（C，D，E）顯示了植入4周（A）和12周（B）后，miR-126和miR-145對不同的三層移植物中巨噬細胞極化的影響。巨噬細胞百分比是從移植的移植物和天然動脈的橫截面圖像中獲得的，分別用CD68抗體對巨噬細胞(C)、CD206抗體對M2(D)和iNOS抗體對M1(E)進行染色。細胞核用DAPI（藍色）復染。＃移植物管腔位置。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

圖9.植入4周后，不同血管移植物中的ECM再生。橫截面分別用H＆E、von Kossa、VVG、Masson三色和番紅O染色，以鑒定組織形態，外植體中鈣化、彈性蛋白、膠原蛋白和糖胺聚糖的存在。＃移植物管腔位置。