DOI: 10.1002/adfm.201910067
華通氏膠（Wharton's jelly，WJ）具有與軟骨組織相似的組成和功能，被認為是組織工程氣管的潛在支架材料。然而，利用WJ構建工程化新生軟骨組織的可行性尚未報道過，更不用說管狀氣管軟骨再生和節段性氣管損傷修復了。在此，制備了三種不同脫細胞WJ基質（DWJM）/聚己內酯（PCL）比（8:2、5:5和2:8）的電紡納米纖維膜。結果表明，隨著DWJM含量的增加，軟骨的降解速度、吸收和細胞粘附能力有所提高，但力學性能有所減弱，但在體內培養12周后，僅DWJM/PCL（8:2）組能獲得滿意的均勻軟骨再生。此外，利用改進的三明治模型，在二維納米纖維膜的基礎上，利用可控的管腔直徑和壁厚構建均勻的三維管狀氣管狀軟骨，其中軟骨細胞膜結構是繞著硅管滾動的。最重要的是，通過將上述方案與先前建立的血管化和上皮化技術相結合，可以同時實現軟骨化、血管化和上皮化，從而在具有與天然氣管相似的生物學結構和功能的兔模型上實現了長期（6個月）的氣管周向損傷修復，為氣管組織工程的臨床應用開辟了一條新的途徑。
圖1.實驗設計概述。第一部分，納米纖維膜的制備。第二部分，納米纖維膜與軟骨細胞結合，用于補片和管狀軟骨再生。第三部分，用頸闊肌瓣包裹軟骨細胞膜，形成新生血管，用于修復兔模型中的節段性氣管病變。
圖2.WJ的脫細胞。A）天然WJ為白色，含有豐富的GAGs、膠原蛋白和HA，如番紅O、天狼星紅和阿爾辛藍染色所示。B）脫細胞后，如HE和DAPI染色所示，核成分幾乎完全清除，C）也通過DNA含量分析得到證實。D）羥脯氨酸的定量分析和E）GAG含量表明，脫細胞過程略微降低了WJ中的膠原蛋白和GAG含量。紅色箭頭代表核成分。縮寫：WJ，華爾頓膠；GAGs，糖胺聚糖；HA，透明質酸；HE，蘇木精和伊紅；DAPI，4'，6-聯脒-2-苯基吲哚；BD，脫細胞前；AD，脫細胞后。*p＜0.05。
圖3.不同DWJM/PCLWJ/PCL膜的形態、直徑分布和力學分析。A）在宏觀和SEM觀察方面，在不同的DWJM/PCL膜之間未觀察到可見的差異。B）直徑分布分析表明，所有DWJM/PCL組中的納米纖維都集中在100和1200 nm之間。C）不同膜的應力-應變曲線有很大差異，膜的楊氏模量隨WJ含量的增加而顯著降低，斷裂應變則呈相反趨勢。*p＜0.05。縮寫：PCL，聚（ε-己內酯）。
圖4.不同DWJM/PCL膜的吸附和降解。A，B）接觸角隨DWJM含量的減少而顯著降低。C）吸水率、E）蛋白質吸收和D）降解速率隨DWJM含量的增加而顯著增加。*p＜0.05。
圖5.DWJM/PCL膜的生物相容性評估。A）SEM和B）生死檢查表明，軟骨細胞可以很好地在不同膜的表面上擴散，而附著的軟骨細胞的數量則隨著DWJM含量的增加而呈上升趨勢，這通過C）細胞接種效率分析得到了證實。D）軟骨細胞在所有組中均表現出良好的增殖能力，并且隨著DWJM含量的增加而趨于增加。*p＜0.05。
圖6.裸鼠皮下培養6周和12周后，工程化補片的總體視圖和組織學檢查。所有樣本在6-12周內均形成軟骨樣外觀，并變白，這表明樣本隨著體內培養時間的延長而成熟。A1-A4，D1-D4）W8P2組的樣本顯示軟骨結構相對均一，番紅O和II型膠原呈強陽性染色。B1-B4，C1-C4，E1-E4，F1-F4）在W5P5和W2P8組中，樣品呈現明顯的異質性結構，含有大量非降解支架，只有部分新軟骨區域顯示II型膠原和番紅O染色陽性。黑色箭頭表示新軟骨區域。藍色箭頭表示剩余支架區域。
圖7.裸鼠新生軟骨形成的定量評價。C） DNA含量、D）楊氏模量、E）GAGs和F）總膠原含量隨PCL含量的增加而顯著降低，隨植入時間的延長而增加，但A）濕重和B）厚度無統計學顯著差異性。*p<0.05。
圖8.裸鼠模型中的氣管軟骨形成。A）將軟骨細胞膜（W8P2）構建體包裹在硅管上3次并皮下植入裸鼠中12周后，管狀樣品形成了軟骨樣組織。B）橫斷面和C）縱斷面的管狀樣品的組織學分析顯示，軟骨結構相對均一，并且對番紅O和II型膠原蛋白具有強陽性染色。
圖9.在兔模型中新血管形成的管狀新氣管。A，B）將軟骨細胞膜（W8P2）構建體包裹在硅管上3次并肌內植入兔12周后，管狀樣品形成血管化的軟骨樣組織。C，C1，C2）管狀樣品的組織學分析顯示出相對均一的軟骨結構，對番紅O和II型膠原蛋白具有強陽性染色。與天然氣管相比，新氣管中的所有定量指標，包括D）楊氏模量以及E）DNA、F）GAG和G）總膠原蛋白含量均相似甚至更高。藍色箭頭表示血管組織。黑色箭頭表示新軟骨。黃色箭頭表示肌肉纖維。紅色箭頭表示包裹的肌肉層的微血管。*p＜0.05。
圖10.節段性氣管重建的結果。A-C）重建后2、4和6個月時移植物管腔區域的支氣管鏡圖像。氣管重建6個月后移植物和天然氣管的大體視圖。G） 吻合處縱截面的番紅O染色。H1，H2）HE和Ⅱ型膠原染色對天然氣管軟骨和移植氣管軟骨的影響。J1，J2）HE和CD31的微血管免疫組織化學染色。K1，K2）HE和上皮細胞角蛋白免疫熒光染色。D、F）嫁接區域在黃色箭頭之間。J1，J2）紅色箭頭表示微血管。
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