既往研究表明，培養在不同彈性模量基材上的細胞能夠感受基材硬度的刺激，使細胞內部產生固定的靜態牽張力，而這種持續的力在細胞內將激活細胞的信號轉導，調控細胞功能。近日，來自蘇州大學BCML研究組制備了一種纖維支架，該纖維支架可以同時模擬人體膠原纖維的彈性模量和直徑大小，并將其應用于纖維環組織工程再生修復的研究。
隨著平板電腦和手機的大量普及，“低頭族”越來越多，椎間盤退變已不是老年人的專利，隨著組織工程學的發展，應用組織工程技術構建仿生椎間盤逐漸成為研究熱點。椎間盤處于一個復雜的力學環境中，生物力學因素在椎間盤退變和再生修復過程中扮演了關鍵的角色。不僅如此，為了適應承受壓縮、剪切等力學刺激，椎間盤的重要組成部分——纖維環的完整性對于保持椎間盤正常的生物力學性質起到至關重要的作用。纖維環是一個非均一的結構，其中直徑偏大、硬度較大的Ⅰ型膠原纖維主要分布于纖維環的外區，而直徑偏細、硬度較小的Ⅱ型膠原纖維和蛋白聚糖等主要分布于纖維環的內區，因此，針對組織工程纖維環再生修復策略需要同時考慮纖維直徑和硬度這兩個因素。
Fig. 1 (A) Schematic illustration of normal and degenerative IVDs. (B) Schematic illustration of the anatomic structure of an IVD. (C) 3D representation of an ovine AF using optical coherence tomography. Individual images on the right side show how collagen orientation changes along radial direction. (Reprinted with permissionfrom Han et al., 2015). (D) Forces and motion contribute to axial loading of IVD that is balanced by the hydrostatic pressure generated in the gelatinous NP. Pressure in NP causes tensile stress in the surrounding AF or “hoop stress”(Reprinted with permission from Bowles and Setton, 2017).
研究者應用“一步法”合成了具有不同彈性模量的聚氨酯材料，并且運用簡單的靜電紡絲技術制備出軟硬度和纖維直徑不同的4種紡絲纖維，即小直徑，軟纖維；小直徑，硬纖維；大直徑，軟纖維；以及大直徑，硬纖維（Fig. 2）。該纖維可以同時模擬膠原纖維的直徑粗細和硬度大小。進一步，我們將纖維環源干細胞（AFSC）種植在直徑和硬度不同的纖維支架上，觀察纖維支架對細胞形態的影響，結果發現在大直徑的紡絲支架上，細胞鋪展較好，呈現類梭形；在小直徑的紡絲支架上，細胞皺縮呈類圓形（Fig. 3）。
Fig. 2. The microstructure of scaffolds observed using SEM. SS: soft, small size fibers; FS: stiff, small size fibers; SL: soft, large size fibers; FL: stiff, large size fibers.
Fig. 3 The morphology of AFSCs on scaffolds.
研究者進一步探索支架的軟硬和直徑粗細對AFSC分化的影響，結果發現支架的軟硬和直徑對纖維環表型標志基因Col-I, Col-II, Aggrecan, Adamts 17, Sfrp2, Col5a1, Col12a1有顯著影響，其中，隨著支架硬度和直徑大小的增加，纖維環外區表型標志基因Col-I, Adamts 17, Sfrp2, Col5a1, Col12a1表達升高，纖維環內區表型標志基因Col-II和Aggrecan表達降低。該研究結果表明：小直徑，軟支架可以模擬纖維環內區，而大直徑，硬支架可以模擬纖維環外區。紡絲支架的直徑大小和軟硬程度均對干細胞分化有顯著影響，且誘導AFSC分泌與天然纖維環相似微觀結構和彈性模量相似區域的細胞外基質分泌（Fig. 4）。
Fig. 4 Expression of AF phenotypic marker genes in AFSCs cultured on PECUU scaffolds after 7 d. Gene expression was normalized to GAPDH expression.
進一步的研究發現，紡絲支架的直徑和軟硬對AFSC分化的影響主要是通過力學敏感轉錄因子YAP介導的，隨著直徑的增大和硬度的增高，YAP的核轉錄增加（Fig. 5）。在四組直徑和軟硬程度不同的紡絲支架上加入YAP的抑制劑Verteporfin后，纖維環表型標志基因表達差異性被消除（Fig. 6）。表明YAP在AFSC分化過程中扮演了關鍵角色。
Fig. 5 YAP nucleus translocation was dependent on stiffness and fiber size of scaffold.
Fig. 6 Mechanical property- and topography-mediated AFSC differentiation was YAP-dependent.
該研究由蘇州大學骨科研究所李斌教授課題組完成，于2019年5月9日在線發表于Acta Biomaterialia。
論文信息：
Genglei Chu, Zhangqin Yuan, Caihong Zhu, Pinghui Zhou, Huan Wang, Weidong Zhang, Yan Cai, Xuesong Zhu, Huilin Yang, Bin Li*. Substrate stiffness- and topography-dependent differentiation of annulus ?brosus-derived stem cells is regulated by Yes-associated protein. Acta Biomaterialia 2019, 92:254-264.
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.05.013
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