生長因子摻入電紡纖維支架以促進緩釋的優化策略開發

DOI: 10.1021/acsami.9b20697

將生長因子摻入生物醫學結構中，用于局部遞送，可產生特定的藥理作用，如誘導細胞生長和分化。這為改善組織再生過程提供了一種有前途的方法。然而，要找到一種合適的方法來提供一種有效的生長因子，并以其長期的釋放動力學載入到生物醫學結構中，仍然是一個挑戰。在本工作中，研究者進行了系統的研究，探討了生長因子摻入亞微米級碳酸鈣核殼粒子（CSPs）和空心二氧化硅粒子（SiPs）中的最佳策略。將這些載體固定在基于聚羥基丁酸酯（PHB）的聚合物支架表面上，其結構中含有或不含有還原氧化石墨烯（RGO），以便檢查摻入生長因子的功能。以骨形態發生蛋白-2（BMP-2）和促紅細胞生成素（EPO）為生長因子，采用物理吸附法、共沉淀法和冷凍誘導加載法等不同的包埋策略，建立了CSPs和SiPs的生長因子模型。結果表明，摻入的生長因子的負載效率、釋放特性和生物活性在很大程度上取決于所選擇的策略。總的來說，與單個支架相比，支架與包含生長因子的藥物遞送系統的組合在組織再生領域具有巨大潛力。

圖1.幾種策略的圖解說明，這些策略用于將生長因子摻入藥物載體中，然后將其固定在電紡纖維支架上。采用物理吸附、共沉淀技術和冷凍誘導加載法摻入生長因子。步驟1包括支架制備方法。步驟2反映了將藥物載體固定到電紡纖維上的過程。步驟3涉及生物學研究，以檢查摻入的生長因子對人間充質干細胞和TF-1細胞的生物學活性。

圖2.支架表征（PHB和PHB-rGO）：PHB（A）和PHBrGO（D）的SEM圖像；PHB（B）和PHB-rGO（E）的纖維直徑分布；PHB（C）和PHB-rGO支架（F）的FTIR光譜。比例尺對應于10μm。帶有PHB（G）和PHB-rGO（H）支架的孔徑分布（插圖）的吸附-解吸等溫線。

圖3.電紡PHB和PHB-rGO纖維的AFM形貌圖像、PFM相位和幅值圖像：純PHB（A）和PHB-rGO（B）纖維； 根據PFM結果獲得的PHB和PHB-rGO的統計分布相位（C）和幅度值（D）。

圖4.CSPs/SiPs沉積前后的CSPs/SiPs和PHB/PHB-rGO支架的SEM圖像：CSPs（A）和SiPs（B）具有相應的粒度分布（C）；PHB（D），PHB@CSPs（E），PHB@SiPs（F），PHB-rGO（G），PHB@CSPs（H），PHB@SiPs（I）。比例尺對應于1μm（A、B）和5μm（D-I）。

圖5.將CSPs/SiPs固定在靜電紡絲PHB/PHB-rGO纖維上：PHB@SiPs和PHB-rGO@SiPs的CLSM圖像（A）；方案展示了將載體固定在聚合物纖維上的過程（B）；用TRITC標記的SiPs修飾的聚合物纖維（PHB-rGO）的3D重建（C）；CSPs/SiPs的固定化效率取決于所用支架的類型（D）；負載BSA-FITC和BSA-TRITC（E）的PHB-rGO@SiPs。比例尺對應于5μm（A、E）。結果表示為平均值±標準偏差，n=4。*表示p<0.05。

圖6.在未經修飾和修飾的支架中培養的人間充質干細胞的細胞粘附和活性：培養24小時后，在PHB、PHB@CSPs、PHB@SiPs、PHB-rGO、PHB-rGO@CSPs和PHB-rGO@SiPs支架上附著的人間充質干細胞的CLSM圖像（用DAPI-藍色染色的人間充質干細胞的細胞核，用鬼筆環肽 AlexaFluor 488-綠色染色的細胞膜，用TRITC-BSA-紅色（A）標記的CSPs和SiPs。比例尺對應50μm；培養24小時后附著在PHB、PHB@CSPs、PHB@SiPs、PHB-rGO、PHB-rGO@CSPs和PHB-rGO@SiPs支架上的人間充質干細胞的細胞密度（B）；用PHB、PHB@CSPs、PHB@SiPs、PHB-rGO培養24小時后人間充質干細胞的細胞活力（以百分比表示），通過活/死分析（C）測定PHB-rGO@CSPs和PHB-rGO@SiPs支架。結果為平均值±標準偏差，n=10。ns表示無顯著性，*表示p<0.05，*表示p<0.005。

圖7.未經修飾和修飾的支架上接種的人間充質干細胞在1、3和7天的增殖：PHB、PHB@SiPs、PHB-rGO和PHB-rGO@SiPs支架上生長的人間充質干細胞在不同時間點（1、3、7天）的CLSM圖像。（用DAPI-藍色染色的人間充質干細胞的細胞核，用鬼筆環肽 AlexaFluor 488-綠色染色的細胞膜，用TRITC-BSA-紅色標記的CSPs和SiPs）（A、B）。比例尺對應100μm；培養1、3和7天后，附著在PHB、PHB@CSPs、PHB@SiPs、PHB-rGO、PHB-rGO@CSPs和PHB-rGO@SiPs支架上的人間充質干細胞的細胞密度（C、D）。結果為平均值±標準偏差，n=10。ns表示無顯著性，*表示p<0.05。

圖8.將生長因子摻入CSPs或SiPs的各種策略（以EPO為例）：示意圖描述了將生長因子并入CSPs和SiPs的途徑（A）；摻入效率（%）取決于生長因子摻入策略的選擇（B）；EPO的釋放曲線取決于生長因子摻入策略的選擇（C）。結果表示為平均值±標準偏差，n=4。

圖9.固定在PHB和PHB-rGO支架上的CSPs和SiPs釋放的EPO的生物學反應（TF-1細胞的增殖率）：TF-1細胞與試樣孵育1、4和7天后的CLSM圖像（A）。比例尺對應于50μm；與試樣（B、C）孵育1、4和7天后，每個區域的TF-1細胞計數。結果為平均值±標準偏差，n=4。ns表示無顯著性，*表示p<0.05，*表示p<0.005。

圖10.人間充質干細胞成骨分化分析：采用不同策略（孵育28天）摻入BMP-2修飾的PHB和PHB-rGO支架上的鈣沉積物和生長的人間充質干細胞的CLSM圖像。含鈣礦物用鈣黃綠素染色（綠色），細胞核用DAPI染色（藍色），細胞骨架用鬼筆環肽AlexaFluor 633染色（紅色）。比例尺對應50μm（A）；礦化基質的濃度通過量化染色礦化基質（B）的ARS的量來確定；在采用不同策略摻入BMP-2的PHB和PHB-rGO支架上培養21、28天的人間充質干細胞的ALP活性（C）。B、C：圖例的顏色與BMP-2摻入策略和培養基條件相對應。虛線粗體框表示所用支架的類型。結果為平均值±標準偏差，n=4。ns表示無顯著性，*表示p<0.05，*表示p<0.005。