收縮性肌球蛋白環和cofilin介導的肌動蛋白分解協同ECM納米形貌傳感

DOI：10.1016/j.biomaterials.2019.119683

細胞外基質（ECM）的納米形貌和納米級幾何結構是細胞粘附、運動和命運決定的重要調控因子。然而，與基質力學和ECM密度的傳感不同，調控ECM納米形貌和納米級幾何結構直接傳感的分子過程尚不十分清楚。本文中，研究者使用由電紡納米纖維光刻（ENL）生成的納米形貌圖案來研究細胞對納米形貌的傳感機制。觀察到肌動蛋白動力學失調，導致肌動蛋白病灶的驚人形成。肌動蛋白組織的這種改變是由肌球蛋白收縮力調節的，但不依賴于長春新堿等適配蛋白。該過程高度依賴于差異整合素的表達，β3整合素表達細胞比β1整合素細胞對納米圖案尺寸更敏感，并且顯示出肌動蛋白組裝和肌動蛋白灶形成的擾動增加。作者認為，在β3整合素表達細胞中，收縮力導致納米肌動蛋白網絡的失穩，塌陷成焦點并隔離肌動蛋白動力學的調節因子，如協同分解的cofilin。因此，與通過粘著力組裝直接協同的基底力學和ECM配體密度傳感相反，作者提出的納米形貌傳感是受遠程傳感機制調節的，遠離焦點粘附并由肌動蛋白結構介導。

圖1.通過電紡納米纖維光刻技術（ENL）生成的纖維粘合劑圖案。a.細胞在納米纖維上擴散的示意圖。放大：與納米圖案化基底接觸的細胞膜的示意圖，用聚合物刷控制粘性納米纖維的寬度（d）和非粘性的高度的步驟（h）。b.納米纖維的表征。直徑為250和1000 nm的SEM（掃描電子顯微鏡）圖像（頂部）。具有高度輪廓的500 nm纖維的AFM（原子力顯微鏡底部）。比例尺，2μm。

圖2.納米模式對細胞粘附的調節與肌動蛋白病灶的發生有關。a.肌動蛋白細胞骨架在納米圖案化基底上擴散的圖像。實驗用LifeAct轉染GEβ3細胞。比例尺為20μm。b.細胞擴散受納米纖維寬度（250、500和1000 nm）和抗粘附背景高度（10、30和60 nm）的影響。c.延時圖像（見補充視頻1-4）顯示細胞在納米圖案化基底上擴散，并顯示肌動蛋白應力纖維隨著納米圖案化尺寸（紅色箭頭）的變化而日益斷裂，以及在納米圖案化基底上擴散時肌動蛋白焦點的形成（藍色箭頭）。d.肌動蛋白在納米圖案化基底上發生的量化。誤差條為s.e.m.，n≥3；每個條件下每個重復樣本至少100個細胞；**，P<0.01；**，P<0.00001；n.s.，無顯著性；統計分析見補充表1和表2。

圖3. GEβ1細胞對納米纖維直徑的反應減弱。a.GEβ1細胞（用LifeAct轉染）肌動蛋白細胞骨架在納米圖案化基底上擴散的圖像。比例尺為20 μm。b.與GEβ3細胞相比，細胞擴散對納米纖維寬度（250、500和1000 nm）和抗粘附背景高度（10和30 nm）的響應降低（見圖2）。c.GEβ1細胞在納米圖案化基底上擴散的延時圖像（見補充視頻5-8）。細胞骨架組裝和應力纖維（紅色箭頭）穩定性受到干擾，盡管與GEβ3細胞相比，最薄的納米纖維（250納米）上仍然存在。在所有的納米圖案（藍色箭頭）上觀察到GEβ1細胞很少有肌動蛋白病灶。d.肌動蛋白在納米圖案化基底上發生的量化。與對照條件進行比較。誤差條為s.e.m.，n≥3；每個條件下每個重復樣本至少100個細胞；**，P<0.01；**，P<0.00001；n.s.，無顯著性；統計分析見補充表3和表4。

圖4.長春新堿不是納米形貌傳感的關鍵調節因子。a.長春新堿募集隨不同納米圖案化基底的粘附大小的變化。b.相應代表性的長春新堿染色圖像。比例尺為20μm。c.細胞上長春新堿KO對基質納米形貌的響應以及長春新堿構建體（Vinc.）和顯性陰性構建體（Vin880）或組成性活性構建體（VinT12）重新表達后的影響。d. 相應的長春新堿和鬼筆環肽圖像。比例尺為50μm。誤差條為s.e.m.，n≥3；每個條件下每個重復樣本至少100個細胞；*，P<0.05；***，P<0.001；n.s.，無顯著性；統計分析見補充表5和表6。

圖5.肌動蛋白動力學而不是黏著斑的穩定作用，可調節納米形貌傳感。a.用Arp2/3（ck666）和formin同源2結構域（smifH2）抑制劑處理的GEβ3細胞對基質納米形貌的響應僅部分降低。b.用福爾明抑制劑處理過的細胞的相應圖像。比例尺為10μm。綠色，新蛋白；紅色，F-肌動蛋白。c.未轉染細胞（空白）或用α-輔肌動蛋白siRNA1轉染的相應圖像。比例尺為10μm。綠色，α-輔肌動蛋白；紅色，F-肌動蛋白。d.α-輔肌動蛋白擊倒后細胞對基質納米形貌的響應僅部分降低（α-輔肌動蛋白-1和-2是針對α-輔肌動蛋白的兩種不同siRNA；N.T.，非靶向性）。誤差條為s.e.m.，n≥3；每個條件下每個重復樣本至少100個細胞；*，P<0.05；n.s.，無顯著性；統計分析見補充表8和9。有趣的是，未發現GEβ1細胞受到兩種抑制劑的影響（補充圖10a/b），并且在所有測試條件下，無論處理過的細胞還是未經處理的細胞，它們對納米形貌的響應都相似。

圖6.收縮性肌球蛋白環調節GEβ3細胞骨架結構和納米形貌傳感。a.肌動蛋白細胞骨架的擾動破壞了納米形貌的傳感。b.細胞骨架破壞后，細胞粘附在納米結構上持續的時間更長。Blebistatin的比例尺為100μm，Y-27632的比例尺為20μm。綠色，長春新堿；紅色，F-肌動蛋白。c.肌球蛋白環在肌動蛋白病灶周圍形成。延時成像突出肌動蛋白焦點和肌球蛋白環的動態（見補充視頻9-11）。比例尺為20μm。誤差條為s.e.m.，n≥3；每個條件下每個重復樣本至少100個細胞；**，P<0.01；n.s.，無顯著性；統計分析見補充表10。

圖7.Cofilin和肌動蛋白的分解協調了納米形貌傳感。a.在納米模式上擴散的GEβ3細胞中形成的肌動蛋白灶處募集cofilin。比例尺為20μm。b.細胞在納米模式上擴散的延時成像，并清晰顯示肌動蛋白病灶處cofilin的共聚焦（見補充視頻12-14）。c.cofilin的敲除破壞了細胞對基質納米形貌的響應（CFL-1和-2是針對cofilin的siRNA；N.T.，非靶向性）。比例尺為100μm。誤差條為s.e.m.，n≥3；每個條件下每個重復樣本至少100個細胞；***，P<0.001；n.s.，無顯著性；統計分析見補充表13。

圖8.基質納米形貌的細胞傳感調控機制。細胞骨架的正常結構及其機械穩態在納米圖案化基底上擴散的細胞中受到干擾，其中粘附只能沿著由ECM幾何形狀確定的某些軸形成。這導致肌動蛋白細胞骨架的不穩定（但不是黏著斑），并形成收縮性肌球蛋白環和肌動蛋白灶。在這些病灶處的Cofilin募集導致細胞骨架的分解。因此，細胞骨架及其復雜的動力學表現為基質納米形貌的主要傳感器，而不是黏著斑。