DOI：10.1016/j.apmt.2019.100495
合適的生態位環境是間充質干細胞（MSCs）參與肌腱分化和再生的關鍵因素。本研究利用可溶性肌腱衍生細胞外基質（sTECM）對定向電紡纖維進行酸中和改性，以期為肌腱再生創造一個最佳的生態位環境，并利用小鼠MSC體外成腱分化和大鼠跟腱再生評價其功效。結果表明，sTECM修飾的超微粒子具有更高的細胞相容性，并能誘導小鼠骨髓間充質干細胞的顯性成肌表型，其中包括硬化劑、肌動蛋白、膠原Ⅲ、莫霍克同源盒、核心蛋白聚糖、纖調蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖等肌腱標志物的增強表達。相比之下，純sTECM組分可促進小鼠MSCs的多系分化，包括腱系分化。這種誘導作用在體內單側機械負荷時進一步增強。此外，sTECM修飾支架的植入為肌腱的原位再生創造了一個理想的生態位環境，包括具有生物活性的sTECM成分、拓撲和機械信號。結果表明，與未改性的肌腱組織相比，sTECM改性的肌腱組織具有組織結構更成熟、組織結構更好、細胞密度和排列更整齊、膠原超微結構更好的特點。定量分析顯示，與對照組相比，膠原纖維直徑明顯增大，力學性能增強，組織分級評分明顯提高，成腱標志物表達水平明顯提高（p<0.05）。這項研究表明，sTECM修飾的pH中性超纖維可能是一種新型的肌腱原位再生生物活性支架，有待在大動物中進一步研究。
圖1.示意流程圖說明了實驗設計。
圖2.sTECM改性酸中和超細纖維的制備與表征。如圖所示，制備了A. sTECM改性殼芯結構超纖維。B.脫細胞后，牛屈肌腱中的天然腱細胞被完全去除。C.組織dsDNA濃度顯示細胞DNA含量完全去除。D.SDS-PAGE電泳顯示脫細胞TECM顆粒（泳道 1）和sTECM（泳道 2）的蛋白條帶分布。E.平行CTS/PLGA和（sTECM-CTS）/PLGA超細纖維的SEM和TEM圖像。F.為了測量接觸角，拍攝了水滴在3個不同時間點下落的照片。之前，在水與物質接觸之前。0秒，水即將接觸到材料表面。1s，水與材料接觸后1秒。測量1s時的接觸角（**p<0.01）。G.CTS/PLGA和（sTECM-CTS）/PLGA支架的應力-應變曲線。H.CTS和凍干sTECM的FTIR光譜以及PLGA、CTS/PLGA和（sTECM-CTS）/PLGA電紡定向纖維的紅外光譜，顯示了它們各自的特征吸收峰。
圖3.sTECM改性酸性中和超細纖維的體外實驗表明，其具有較好的生物相容性和誘導能力。A.將骨髓間充質干細胞接種于超細纖維上，進一步觀察細胞的黏附、活力、增殖和肌腱分化情況。B.CCK-8分析顯示（sTECM-CTS）/PLGA在第7天對細胞增殖有輕微的優勢。C.掃描電鏡顯示細胞接種后第1天在兩種類型的超細纖維上均顯示出細長的細胞形態。第7天，在sTECM改性的超細纖維上觀察到更多的膠原沉積。D.活細胞/死細胞分析顯示，第7天，sTECM改性的超細纖維上的死細胞較少。放大倍率為100×；比例尺=200 μm。E.在sTECM改性的超細纖維上培養7天和14天時，細胞表達了更高水平的多種肌腱基因。誤差條表示標準誤差。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
圖4.sTECM改性的超細纖維促進了大鼠跟腱體內再生。A.再生肌腱和正常跟腱的大體圖和組織學。H&E染色顯示界面部和中部的組織結構。膠原纖維及其亞型分別通過Masson三色染色和Sirius紅染色（在偏振光下觀察）識別。 放大倍率，100×，比例尺=250 m。 B.對FS、FA、RN、VC和DC參數的組織學評分表明，sTECM改性的超細纖維的體內優點。*p<0.05。
圖5.sTECM改性的超細纖維改善了新肌腱的超微結構和生物力學性能。A.插圖展示了正常肌腱的超微結構和透射電鏡圖像。本研究采用透射電鏡觀察膠原纖維。放大倍率，12000x；比例尺=200nm。B.透射電鏡顯示，移植后12周，ECM組在兩個時間點都有膠原纖維，ECM組的膠原纖維直徑增加。放大倍率，12000x；比例尺=200 nm。C. 直方圖顯示膠原纖維直徑。D.檢測體內工程肌腱和正常跟腱的最大載荷、楊氏模量和抗拉強度。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
圖6.sTECM誘導MSCs體外成腱分化，促進新生組織中成腱基因的表達。A.除COL1外，ECM組的成腱基因表達上調。此測定法中的誤差條表示標準誤差。B.用sTECM培養時，細胞維持其星狀或擴展的形態。放大倍率，50×；比例尺=100μm。C，CCK-8分析顯示sTECM處理后MSCs細胞增殖延遲。D.用sTECM培養3天后，與成腱分化相關的標記基因表達上調。誤差線表示標準誤差。綜上所述，sTECM在體外能夠誘導MSCs的成腱分化，并能增強體內募集的宿主細胞的成腱表型。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
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