DOI: 10.1021/acsbiomaterials.9b01068
腫瘤微環境具有腫瘤進展所需的基本成分，包括生化信號和機械提示。為了研究微環境因素對尤因肉瘤（ES）發病機制的影響，我們從電紡聚己內酯（PCL）支架中構建了一個無細胞三維骨腫瘤生態位，該支架包含骨樣結構、細胞外基質（ECM）和礦化作用。PCL-ECM構建體是由含有成骨性人間充質干細胞（MSCs）培養的PCL支架脫細胞而成。與單純PCL支架相比，PCL-ECM構建體在體內模擬腫瘤結構并增加ES細胞增殖。與單層對照相比，3D環境通過雷帕霉素（mTOR）的機制性靶點促進了典型胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）信號級聯的下調，兩者都是近期臨床試驗的靶點。除了下調典型的IGF-1R信號傳導外，3D環境還促進了IGF-1R的核定位和轉錄活性的降低，體外藥物試驗顯示3D環境產生了對mTOR抑制和化療耐藥性細胞表型。我們的多功能PCLECM結構允許研究各種微環境元素在ES腫瘤生長、癌細胞形態和誘導耐藥性細胞表型中的作用。
圖1.三維PCL-ECM結構的生成。（A）從電紡PCL和成骨MSC培養（OsMSCs）構建三維骨腫瘤龕的過程示意圖。（B）脫細胞前后，在電紡PCL支架上的成骨培養基中培養12天的OsMSCs的代表性共焦圖像（藍色，Hoechst表示細胞核；綠色，鬼筆環肽表示肌動蛋白；比例=50μm）。（C）脫細胞前后在電紡PCL支架上成骨培養基中培養12天的OsMSCs的代表性掃描電鏡照片（左面板：比例=200μm；右面板：比例=20μm）
圖2.PCL支架中OsMSCs的成骨特性的表征。（A）在基礎培養基（MSC）中以單層培養的未分化MSC，在成骨培養基中以單層培養的MSC（OsMSC）或在成骨培養基中以PCL支架培養的MSC（PCL+OsMSC）中檢測到的堿性磷酸酶（ALP）活性持續12天（n=5）。Tukey HSD事后檢測的單向方差分析：n.s.＝無顯著性，*p＜0.05。（B）在沒有細胞（PCL）或有OsMSC（PCL+OsMSC）的成骨培養基中孵育12天的支架的鈣含量（n=5）。學生的t檢驗***p<0.001。（CD）兩個具有OsMSC的脫細胞PCL支架的25μm代表性切片，它們構成PCL-ECM構建體，用茜素紅（C）染色以沉積鈣，或用Masson 三色染色（D）細胞核（深藍色），非膠原蛋白（紅色）和膠原蛋白（藍色）。PCL-ECM構造的表面朝向圖的頂部。比例=50μm。
圖3.骨腫瘤微環境中ES的增殖和形態。（A）在96孔板中以單層，直徑6 mm的PCL支架或直徑6 mm的PCL-ECM構建體（n=5）培養的ES細胞的細胞計數。帶有Tukey HSD事后檢測的雙向方差分析：n.s.＝無顯著性，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。（B）代表性的SEM顯微照片，描繪了PCL支架和PCL-ECM構建體上的ES細胞和ECM的形態。紅色箭頭指示3D環境中的拓撲變化（左圖：比例=200 μm；右圖：比例=20 μm）。（C）代表性的共聚焦圖像，描述了單層培養的ES細胞在PCL支架上或PCL-ECM構建體（藍色，Hoechst；綠色，鬼筆環肽；比例=50 μm）上的生長和聚集。（D）ES細胞的代表性共聚焦顯微鏡圖像，描述了可變微環境中的形態變化。白色箭頭表示單層細胞中明顯的絲狀偽足，紅色箭頭表示細胞包裹在PCL纖維周圍，白色箭頭表示PCL-ECM結構中ECM沉積的區域，在該區域周圍細胞呈球狀生長（比例=20 μm）。
圖4. IGF-1R的激活。（A）代表性的共聚焦圖像，描繪了單層培養的ES細胞在PCL支架上或在PCL-ECM構建體上的IGF-1R的激活和定位（藍色，Hoechst代表核；綠色，鬼筆環素代表肌動蛋白；紅色，IGF-1R ；青色，pIGF-1R；比例=50 μm）。（B）Western免疫印跡突出了單層培養的ES細胞在PCL支架或PCL-ECM構建體上培養5天的IGF-1R/mTOR信號級聯激活的過程。（C）Western免疫印跡突出顯示了IGF-1R轉錄復合物活性、FAM21A和c-JUN下游產物的表達。組蛋白H3的負載對照印跡（B）和（C）與來自同一實驗的代表性印跡相同。
圖5.對網格蛋白抑制的IGF-R激活和定位反應。（A）和（B）單層培養的ES在PCL支架和PCL-ECM構建體上的代表性共聚焦顯微圖像，以及描繪與小分子網格蛋白抑制劑Pitstop?2孵育20分鐘之前和之后，IGF-1R的定位（A）或pIGF-1R的定位（B）（比例=50 μm）（C）IGF-1R（左）或pIGF-1R（右）的核共定位的Manders共域系數（MCC），由扣除滾動球背景和轉換Costes自動閾值后的6個共聚焦圖像計算得出。Tukey HSD事后檢測的雙向方差分析：字母代表獨立組，p<0.05；****p<0.0001；n.s.=無顯著性；字母相同的組沒有顯著性差異。
圖6.3D培養物可促進ES對mTOR抑制和阿霉素的抗性。與未經處理的對照組相比，用（A）地磷莫斯和（B）達洛妥珠單抗（n=8）處理3天后，單層培養的ES細胞在PCL支架或PCL-ECM構建物中存活的百分比。Tukey HSD事后檢測的單向方差分析：字母代表獨立組，p<0.05；n.s.=無顯著性；字母相同的組沒有顯著性差異。（C）添加或不添加IGF-1R/mTOR靶向治療對阿霉素的劑量反應曲線。比較了阿霉素單獨治療組之間的阿霉素劑量反應（左圖）；mTOR抑制劑地磷莫斯（中圖）；或在IGF-1R靶向單克隆抗體達洛妥珠單抗存在下使用阿霉素（右圖）。使用S形，四參數對數回歸擬合劑量-反應曲線。每個點均顯示為平均值±標準偏差。（對于每個阿霉素濃度，n=3）。
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