DOI:10.1016/j.actbio.2019.11.051
表皮突是皮膚的表皮和真皮的交界處，在穩態中起多種作用，包括通過增加接觸面積來增強粘附力并充當表皮干細胞的生態位。但是，工程皮膚（ES）通常不包含這些結構。為了開發具有網狀表皮突的工程皮膚，用分數CO2激光處理人成纖維細胞播種的真皮模板，在表面形成間隔均勻的孔。將經過和未經過激光處理的構建體接種角質形成細胞，培養10天，然后移植到無胸腺小鼠上4周。移植時在激光圖案化（脊狀）樣品中觀察到表皮突狀結構，并在體內得以維持。脊狀移植物在移植時和移植后4周顯示出比非激光（平坦）移植物更高的屏障功能。體內脊的存在與角質形成細胞增殖、表皮面積和基底膜長度增加相一致。這些結果表明，該方法可用于開發具有表皮突的工程皮膚移植物，脊形模式在移植后至少4周內保持穩定，并且這些脊的存在促進了表皮增殖和屏障功能的建立。
圖1.在播種培養的角質形成細胞之前，激光處理之前（平整，A＆B）和之后（脊狀，C＆D）的成纖維細胞播種的真皮成分的共聚焦圖像。微熱區在間距和形態上是一致的。激光燒蝕周圍的區域由核（藍色）組成，但不含F-肌動蛋白（綠色）。比例尺=200μm。
圖2.體外培養第1天（A＆D），第5天（B＆E）和第11天（C＆F）的平整（A-C）和脊狀（D-F）工程皮膚的層粘連蛋白-332（綠色）和細胞角蛋白（紅色）的免疫組織化學染色。在所有切片中，細胞核均用DAPI（藍色）復染。盡管最初分散在脊突組的真皮中，但到第11天，角質形成細胞濃縮并在網狀真皮中形成網狀樣突起，并具有連續的基底膜。比例尺=100μm。
圖3.在體外通過平整和脊狀工程皮膚的表面電容（SEC，B）評估的細胞活力（A）和屏障形成，報告為平均值±SE。在培養第0、1、5和11天時，各組之間的生存力沒有顯著差異（每組n=6，p>0.05）。在培養的第5天，表面水合作用相似，盡管在培養的第11天，脊狀工程皮膚的水合作用明顯低于平整工程皮膚（每組n=6，p<0.01）。用單因素方差分析、圖基事后檢驗法且p<0.05來確定統計顯著性。
圖4.培養第1、5和11天的平整和脊狀工程皮膚的PCR分析，報告為平均值±SE。AXIN2（A），LGR6（B）和LRIG1（D）表達在第5天達到峰值。在第11天，脊狀樣品的AXIN2，DLL1（C）和LRIG1表達增加（p<0.05）。用單向方差分析、圖基事后檢驗法且p<0.05來確定統計顯著性。
圖5.在第2周（A＆C）和第4周（B＆D）處，平整（A＆B）和脊狀（C＆D）移植物的體內圖像。兩組的外觀和收縮隨時間變化相似。所有圖像以相同焦距拍攝。比例尺= 0.5cm。
圖6.移植后第2周（每組n=12）和移植后第4周（每組n = 6）平坦和脊狀移植物的表皮水分損失（TEWL），報告為平均值±標準誤差。在移植物對面的背部測量正常小鼠皮膚（第4周，n=12），平均值用虛線表示。隨著時間的推移，兩組的TEWL均顯著下降。但是，在第4周，僅脊狀移植物顯示出與正常小鼠皮膚相似的值（p>0.05）。用單向方差分析、圖基事后檢驗法且p<0.05來確定統計顯著性。
圖7.移植后1周（A&E）、0周（B&F）、2周（C&G）和4周（D&H）的扁平（A-D）和脊狀（E-H）的細胞核（藍色）、層粘連蛋白-332（綠色）、Ki67（紅色）和兜甲蛋白（白色）的免疫組化染色。在所有切片中，用DAPI（藍色）標記細胞核。在移植時形成網脊，并在移植后4周持續存在。比例尺=100μm。
圖8.在體外培養第5天（第1周）、移植時（第0周）和移植后第2周和第4周，在40倍放大倍率下（每組離散FOV，n=16），每個視野的平坦和脊狀樣品的基底膜長度（A）、表皮面積（B）和Ki67+角質形成細胞（C）的定量，報告為平均值±SE。脊狀標本基底膜長度（層粘連蛋白332+染色距離）在各時間點均較大。表皮區域，即層粘連蛋白332+染色的表淺區域，移植時脊狀樣品中的表皮區域增加，并在體內保持不變。角質形成細胞增殖，即層粘連蛋白322+染色表面的Ki67+細胞數量，在移植前和移植后一周增加。用單向方差分析、圖基事后檢驗法且p<0.05來確定統計顯著性。
圖9.移植時（A＆D），移植后2周（B＆E）和移植后4周（C＆F）的扁平樣品（A-C）和脊狀樣品（D-F）進行三色染色。在第0周時，扁平樣品中膠原蛋白的含量增加，而脊狀樣品顯示出更長的真皮表皮交界處。在第2周時，脊狀樣品的真皮從第0周起明顯增加了膠原蛋白的沉積并致密化。在第4周，脊狀樣品顯示出高于平坦樣品的膠原蛋白染色密度和強度。比例尺= 100μm。
圖10.移植后第4周，對扁平（A-D）和脊狀（E-H）標本的角蛋白2（A&E，綠色）、6（C&G，綠色）和15（B&F，紅色）、ITGA6（A&E，紅色）、ITGB1（D&H，綠色）和骨膜蛋白（B&F，綠色）進行免疫染色。細胞核用DAPI（藍色）復染。雖然由于基底膜長度和表皮面積的增加，脊狀組的整體存在增加了，但兩組之間沒有觀察到局部差異。比例尺=50μm。
圖11.移植時以及移植后2和4周時，平坦和脊狀工程皮膚的基因表達分析，報告為平均值±標準誤差。AXIN2（A）、LRG6（B）和LRIG1（D）的表達隨時間增加，而DLL1（C）的表達在兩組中均降低（每組每個時間點n=6，p<0.05）。用單向方差分析、圖基事后檢驗法且p <0.05來確定統計顯著性。
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