近日，南京林業大學黃超伯教授、熊燃華教授聯合比利時根特大學Stefaan C. De Smedt院士和Kevin Braeckmans教授在Nature Nanotechnology上在線發表了一篇題為“Photothermal nanofibers enable safe engineering of therapeutic cells”的研究型論文。該研究表明嵌入生物相容性電紡納米纖維中的光敏氧化鐵納米顆粒通過光熱效應誘導膜通透性，并且不需要與納米顆粒直接細胞接觸。光熱納米纖維已經成功地用于傳遞效應分子，包括CRISPR-Cas9核糖核蛋白復合物和短干擾RNA，到粘附和懸浮細胞，包括胚胎干細胞和難以轉染的T細胞，而不影響細胞增殖或表型。作者表示，使用光熱納米纖維進行細胞內遞送是一個有前景的概念，可以安全、更有效地用于細胞免疫治療。
圖1.研究成果設計圖
主要研究內容包括：
（1）研究了光敏納米粒嵌合的納米纖維結構與胞內遞送效率的構效關系；重點關注靜電紡絲制備參數，控制嵌合光敏納米粒與纖維表面接觸的細胞距離，以保證嵌合光敏納米粒生成的光熱效應能有效增強細胞膜通透性，得到最優光響應納米纖維結構，用于生物大分子藥物胞內遞送；
（2）進一步，研究了光響應納米粒生成的光熱效應與細胞膜作用機理；主要關注光輻照光敏納米粒生成光熱效應的過程，及其作用于細胞膜增強細胞膜滲透性的機制；
（3）應用小鼠模型，采用最優光響應納米纖維遞送生物高分子藥物小干擾核酸到人體免疫T細胞內，以形抑制PD-1蛋白的表達，從而提供治療T細胞（CAR-T細胞）抑制腫瘤增長，最終達到增強治療效果的目的。
1、光熱納米纖維的制備與表征
將聚己內酯 (PCL) 和 氧化鐵納米粒（IONPs） 以不同重量百分比溶解在 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)-四氫呋喃 (THF) 中制成混合物，然后進行靜電紡絲制備成光熱納米纖維。
從SEM圖和TEM圖可以看出，纖維的平均直徑約為 300 nm，直徑不隨 IONP 濃度變化而變化（圖 2b-d）。共聚焦顯微鏡顯示，靜電紡絲 1 小時后，光熱納米纖維（PEN ）網的厚度逐漸增加至 4 μm（圖 2e、f）。當向納米纖維中添加越來越多的 IONP 時，PEN 網的厚度沒有顯著變化（圖2g）。
圖2：光熱納米纖維胞內遞送概念及光熱納米纖維的表征。(a)光熱納米纖維的胞內遞送原理示意圖。(b)含有0和1 wt%光響應納米粒的納米纖維的SEM和TEM圖像。(c)不含納米粒的納米纖維直徑分布圖。(d)含不同納米粒(0 - 5%)的納米纖維直徑。(e)納米纖維(不含納米粒)的共聚焦顯微鏡圖像。(f)纖維膜厚度隨著靜電紡絲時間的變化。(g)30 min紡絲后，納米纖維膜厚度與含納米粒的關系。(h)20 kV的SEM成像清楚地顯示了納米粒在纖維內部(下)，而在1.5 kV較低電壓下則不是這樣。(i)單位面積的納米粒團簇與納米粒含量的關系。(j-m)納米粒在納米纖維中的分布示意圖以及相應結果。
2. 光熱納米纖維高效、安全的大分子胞內傳遞
首先，光熱納米纖維被證明能高效、安全遞送大分子到HeLa貼壁細胞。通過共聚焦顯微鏡圖像結果定量分析，得到增加激光能量密度或納米粒的含量能提高遞送效率，但細胞毒性也逐漸增加；發現當激光能量密度為0.08 J/cm2 和納米粒含量為1%時，得到最優胞內遞送結果（圖3a）。接下來，測試了光熱納米纖維對Jurkat懸浮細胞的遞送效率。發現當激光能量密度為0.16 J/cm2和納米粒含量為2%時，得到最優胞內遞送結果（圖3b）。最后，質譜檢測結果表明包裹在納米纖維中的納米粒沒有泄露到溶液或細胞（圖3c-f）。
圖3：光熱納米纖維高效、安全的大分子胞內傳遞。(a)紅色熒光標記的10 kDa葡聚糖（RD10）的HeLa貼壁細胞遞送效率、存活率與激光能量密度、光敏納米粒含量的關系。(b)Jurkat懸浮細胞遞送效率、存活率與激光能量密度、光敏納米粒含量的關系。(c-d)光照射后ICP-MS/MS測定細胞中Fe含量的實驗示意圖；不同實驗條件下，Fe含量的測量結果。(e-f)光照射后ICP-MS/MS測定水溶液中Fe含量的實驗步驟示意圖，以及不同實驗條件下的Fe含量的測量結果。
3. 光熱納米纖維應用于生物大分子siRNA或CRISPR/Cas9的胞內遞送研究
成功實現模型大分子胞內遞送后，光熱納米纖維進一步被應用于生物功能大分子siRNA或CRISPR/Cas9的胞內遞送。首先，光熱納米纖維將抗綠色熒光蛋白(GFP)的siRNA遞送到穩定表達GFP的H1299細胞中。研究結果表明隨著siRNA濃度(0.5, 1, 2和5μM)的增加，GFP的靜默效率越高，同時不影響細胞活性（圖4a-f）。接著，光熱納米纖維將敲除GFP表達的RNPs遞送到H1299細胞中。研究結果表明GFP的敲除效率隨著RNP濃度的增加而增加，最高RNP濃度的GFP敲除效率可達80%（圖4g-j）。
圖4：光熱納米纖維應用于生物大分子siRNA或CRISPR/Cas9RNPs的胞內遞送研究。(a)光熱納米纖維將siRNA或RNPs遞送到H1299細胞以抑制或敲除綠色熒光蛋白（GFP）表達的實驗示意圖。(b)共聚焦顯微鏡圖像顯示了對照和siRNA胞內遞送的H1299細胞GFP的表達。(c)相應的流式細胞儀直方圖結果。(d-f)24小時后H1299細胞在不同情況下的GFP表達和活性結果。(g-h)光熱納米纖維將RNPs遞送到H1299細胞以敲除GFP表達；共聚焦顯微鏡圖像和相應的流式細胞儀結果。(i-j)48小時后H1299細胞在不同情況下的GFP敲除和活性結果。
4. 光熱納米纖維應用于人胚胎干細胞(hESC)高效安全的生物大分子胞內遞送
在該工作中，光熱納米纖維還被應用于細胞治療相關的人胚胎干細胞（hESCs）的胞內遞送。實驗結果表明隨著遞送效率逐漸提高，但同時細胞活性也降低了；當I=0.08 J/cm2時，獲得最優遞送效率為63%；與此相比，傳統電穿孔方法在最優程序(CE-118)的遞送率僅為25%（圖5a-d）。同時，研究結果表明光熱納米纖維處理后的人胚胎干細胞不影響干細胞功能特性（圖5e-i）。最后，光熱納米纖維成功的應用到遞送RNPs到hESCs細胞，以敲除X染色體上的IL-2Rgamma (IL-2R)基因表達（圖5j-k）。
圖5：光熱納米纖維應用于人胚胎干細胞（hESC）高效安全的生物大分子胞內遞送。(a)不同實驗條件下，hESC胞內遞送效率和細胞活性。(b)不同電穿孔條件下的hESC遞送效率和細胞活性。(c)共聚焦顯微鏡圖像顯示了hESC遞送效率和細胞活性。(d)在最優光熱納米纖維和電穿孔實驗條件下處理hESC后，24 h后兩者細胞存活率和遞送效率。(e)最優實驗條件下處理hESC后，細胞生長效率。(f)光熱納米纖維處理hESCs24小時后，轉錄因子Oct4 (Pou5f1)、Sox2和Nanog免疫染色共聚焦顯微鏡圖像。(g)Oct4 (Pou5f1)、Sox2和Nanog轉錄因子的量化結果。(h)標記特異蛋白TNNT2和NKX2.5的免疫染色共聚焦圖像展示了hESCs分化為心肌細胞。(i)心肌細胞TNNT2和NKX2.5的量化結果。(j)hESCs在不同實驗情況下的Sanger基因序列。(k)通過Sanger測序分析了IL-2R敲除效率。
5. 光熱納米纖維應用于人T細胞高效安全的生物大分子胞內遞送
最后，光熱納米纖維被應用于人供體來源的T細胞的胞內遞送。研究發現光熱納米纖維的最佳遞送效率為40.7%，而傳統電穿孔方法為19.3%，盡管在遞送siRNA以抗PD-1蛋白表達效率類似（圖6a-d）。為保證遞送安全性，遞送方法應該最小限度地干擾治療細胞的功能特性。結果表明光熱納米纖維對T細胞形態、表型、激活狀態的功能沒有顯著影響，而以此相反的是電穿孔對T細胞功能影響較大（圖6e-f）。最終導致了電穿孔處理的T細胞在目標細胞殺傷功能減弱，而光熱納米纖維處理的T細胞能保持原有功能特性（圖6i-j，圖7）。
圖6：光熱納米纖維應用于人T細胞高效安全的生物大分子胞內遞送。(a)光熱納米纖維應用于T細胞遞送。(b)電穿孔后的T細胞遞送。(c-d)光熱納米纖維和電穿孔方法遞送小干擾核酸siPD1到T細胞以抑制PD1蛋白表達。(e)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞1小時后，對細胞尺寸的影響。(f)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，相對鈣離子隨時間的變化。(g)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，幾種關鍵促炎或抗炎細胞因子的分泌情況。(h)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，激活標記物CD137、CD154以及PD1的蛋白表達情況。(i)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，細胞的增殖情況。(j)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，細胞在體外對目標細胞殺傷情況。
圖7：光熱納米纖維處理后的T細胞在體內保持著細胞功能特性。(a)光熱納米纖維將siRNA遞送到CAR-T細胞以證明在SKOV3腫瘤小鼠模型有效性的實驗示意圖。(b)靜脈注射CAR-T細胞（陰性對照，n=5）、光熱納米纖維將siPD1遞送到CAR-T細胞（實驗組，n=4）、CAR-T細胞聯合PD1-抗體給藥（陽性對照，n=4）的腫瘤大小隨時間變化。
總之，該工作開發了一種新型的生物大分子胞內遞送方法，其不僅保持了光敏納米粒在光響應胞內遞送的主要優點，同時避免了其致命缺點，即光敏納米粒殘留在細胞內產生潛在的毒副作用。通過優化光敏納米粒在納米纖維的嵌合度，以控制作用于細胞的光熱效應，創造性地將光響應納米粒胞內遞送與靜電紡絲技術相結合，實現了納米粒與細胞非接觸的生物大分子藥物安全高效的胞內遞送，增強生物大分子藥物藥效，有望進一步提高疾病治療效果。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41565-021-00976-3
實驗室主頁：
https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent
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