中國科學技術大學俞書宏&重慶大學羅忠Adv. Funct. Mater.：具有抗腫瘤和組織修復功

DOI: 10.1002/adfm.202008732

具有抗腫瘤和組織修復功能的新型生物材料在黑色素瘤術后護理中變得越來越重要，它可以延長患者的無瘤生存期，同時促進創傷組織的重建。為此，本研究設計了一種生物可吸收復合支架，該支架是通過靜電紡絲將基于治療性無定形碳酸鈣（ACC）的納米制劑沉積在明膠/聚己內酯（GP）納米纖維中制成的。ACC納米制劑與Fe2+預活化的博來霉素結合，以提供生物催化增強的治療效果，而可水解的ACC內容物可充當質子清除劑，以改善腫瘤組織酸性，從而持續抑制腫瘤的復發和轉移。酸觸發的ACC分解也釋放Ca2+，以活化下游Wnt/β-catenin信號通路，其可與GP底物的愈合作用產生協同效應并加速傷口再生。綜上，納米工程支架可以作為黑色素瘤術后治療的輔助手段。

圖1.ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP支架的合成過程及其對同時進行黑色素瘤治療和傷口愈合的互補能力。

圖2.樣品的物理表征。圖（a）和（b）為Fe2+-BLM負載ACC基納米樣品（a：ACC@Fe2+/BLM，b：ACC@Fe2+/BLM-CaSi）的TEM圖像，圖（c）為ACC@Fe2+/BLM-CaSi的SAED圖譜。圖（d）和（e）為不同支架在不同放大倍率下的SEM圖像（d：GP，e：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。圖（f）是ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP的TEM圖像。圖（g）是基于ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP掃描透射電子顯微鏡分析的元素映射結果。

圖3.支架的藥物釋放動力學和細胞作用。a）通過UV-vis吸光度測量從SBF中的ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP釋放BLM的動力學。圖（b）和（c）通過ICP分析得出Ca離子和Fe物種的釋放曲線。圖（d）顯示了在不同支架上孵育3天后，HaCat細胞中Ca2+分布的CLSM基分析（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。圖e（I-IV）顯示了在不同支架上孵育3天后的HaCat細胞的形態變化（I：GP，II：ACC-CaSi-GP，III：ACC@BLM-CaSi-GP和IV：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。f）通過CLSM觀察在不同支架上孵育3天后的HaCat細胞的形態變化（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。藍色、紅色和綠色分別代表細胞核、F-肌動蛋白和肌球蛋白。

圖4.支架在體外的生長抑制作用。a）在不同支架上生長48小時后，B16F10細胞中細胞內羥基自由基水平的變化。b）用各種支架處理48小時后，B16F10細胞中DNA斷裂嚴重程度的DNA階梯分析。c）通過CLSM觀察B16F10細胞在不同支架上生長48小時后細胞內羥基自由基的分布（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。d）通過流式細胞術分析接種于不同支架后B16F10細胞的凋亡水平。e）用各種支架處理48小時后B16F10細胞凋亡的CLSM分析（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。藍色表示細胞核，而紅色表示細胞膜。

圖5.治療誘導黑色素瘤體內抑制作用的評估。a）比較不同治療組中腫瘤大小的視覺照片。用不同支架對B16F10荷瘤小鼠進行15天的治療，然后收集腫瘤以進行成像。b）對不同治療后腫瘤體積變化的統計分析（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。c）治療15天后不同組腫瘤重量的統計分析。d）不同組小鼠體重變化的統計分析。e）不同組腫瘤組織樣品的H＆E和TUNEL染色結果（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP和V：ACC@Fe2+-BLM-CaSi-GP）。

圖6.治療誘導黑色素瘤轉移抑制作用的評估。a）使用ANNA探針（I500/I540）獲取經不同支架治療后的B16F10荷瘤小鼠的腫瘤部位熒光圖像和局部pH。b）經不同支架治療后B16F10荷瘤小鼠肺轉移結節的圖像（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。c）通過免疫印跡分析經不同治療后B16F10荷瘤小鼠中關鍵轉移標志物（包括PDL，P-p38，NF-Kb和MMP-9）的表達水平（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。d）通過免疫熒光成像評估經不同治療后B16F10荷瘤小鼠中MMP-9（綠色）的表達（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSiGP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。藍色顯示細胞核。

圖7.支架生物降解及創面再生的體內評估。a）經不同支架治療后，糖尿病小鼠中傷口修復率的攝影圖像。b）第15天，對糖尿病小鼠關鍵傷口愈合標志物（包括Wnt5a，β-catenin，Keratin-1和Loricrin）的表達進行蛋白質印跡分析。第0天用不同支架治療的小鼠（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。c）體內孵育不同天數后，ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP支架形態變化的SEM圖像。（d）第15天在糖尿病小鼠傷口組織中的Wnt5a、β-catenin、Keratin-1和Loricrin表達水平的免疫組織化學圖像。（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP和V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

圖8.復合支架的傷口愈合功效和作用機理。a）15天治療后，通過CD31免疫熒光研究糖尿病小鼠傷口血管新生的情況。覆蓋不同支架的傷口（I：對照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP和V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。圖（b）和（c）為上述5個治療組的傷口組織標本的H＆E和Masson三色染色結果。d）生物可吸收支架的分子機制增強了治療效果，以防止黑色素瘤復發和轉移，同時加速了手術傷口的愈合。