DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.120746
經證實組織損傷后細胞向缺氧的過渡可以促進多個組織的血管生成和再生。為了利用這一優勢，研究人員制備了多種模擬缺氧的支架材料，然而人工小直徑血管移植物（SDVGs）的供氧狀態還未得到深入研究。因此，本研究評估了植入大鼠腹腔動脈的電紡PCL移植物的氧氣進入狀態。近腔區和移植物壁的離光表面是常氧的，只有移植物壁的內部是缺氧的。鑒于移植物的不同氧氣進入狀態以及血管再生對SDVG植入成功的關鍵作用，本工作研究了用HIF-1α穩定劑二甲基草酰甘氨酸（DMOG）修飾SDVGs是否可以實現低氧模擬反應，從而改善整個移植物壁的血管再生。首先，通過靜電紡絲法制備了DMOG負載PCL移植物，以支持DMOG在兩周內的持續釋放。體外實驗表明，DMOG負載PCL墊具有顯著的生物學優勢，包括：促進人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）增殖、遷移和促血管生成因子的產生，并刺激M2巨噬細胞極化，進而促進巨噬細胞對HUVECs遷移和平滑肌細胞（SMCs）收縮表型的調節。這些有益作用可歸因于在常氧條件下HUVECs和巨噬細胞中HIF-1α的穩定性。本研究結果表明，DMOG負載PCL移植物在腹動脈置換模型中改善了移植物的內皮化、收縮性平滑肌細胞再生和血管化，調節了移植物的炎癥反應，從而促進了血管再生。
圖1.植入大鼠腹動脈7天后PCL移植物氧氣進入狀態的原位評估。（A）手術時的代表性圖像顯示了植入的移植物，在移植物附近，一側的肌肉被結扎，而另一側的肌肉是正常的。手術后7天，腹膜注射HypoxyprobeTM-1。2小時后，取結扎肌肉（B），正常肌肉（C）和植入的PCL移植物（D），使用Hypoxyprobe-1試劑盒對其進行染色。與二級抗體孵育的切片僅作為陰性對照。（B）結扎肌肉切片顯示完整且較高的低氧探針熒光信號，這表明結扎肌肉處于缺氧狀態。（C）在正常肌肉切片中未檢測到低氧探針熒光信號，這表明正常肌肉處于常氧狀態。（D）植入的PCL移植物在第7天的代表性低氧探針染色圖像，d1是O2從動脈血擴散到PCL移植物壁內側的距離；d2是O2從周圍組織擴散到PCL移植物壁外側的距離。（E）d1和d2的氧氣擴散距離。（F）定量分析低氧探針熒光面積與PCL移植壁面積之比。（G）PCL移植物壁內不同位置的氧氣進入狀態示意圖。
圖2.PCL和DMOG負載PCL血管移植物的表征。四種類型移植物的橫截面（A）和內腔表面（B）的SEM圖像。定量移植物的纖維直徑（C）和孔徑（D）。（E）四種移植物的代表性應力-應變曲線。（F）DMOG從不同移植物中的累積釋放量。
圖3.PCL和DMOG負載PCL墊的血液相容性評估。（A）通過阿的平染色觀察在不同PCL和DMOG負載PCL墊上的血小板粘附。（B）基于阿的平染色圖像計數粘附的血小板數目。（C）PCL和DMOG負載PCL墊上血小板粘附的代表性SEM圖像。（D）通過人C3a酶聯免疫試劑盒定量在不同PCL墊上的人C3a活化。還通過相同方法測試了用作對照的人體血液。定量PCL和DMOG負載PCL墊（n=5）的（E）凝血酶原時間（PT），（F）活化部分凝血活酶時間（APTT）和（G）凝血酶時間（TT）。（H）具有或不具有DMOG負載的PCL墊的溶血率（n=5）。
圖4.PCL墊釋放的DMOG對HUVECs功能的影響。（A）通過WB分析在PCL或DMOG負載PCL墊上培養3天的HUVECs的HIF-1α蛋白表達。（B）根據WB分析定量HIF-1α蛋白。（C）通過人VEGF ELISA檢測在各種墊上培養3天的HUVECs的VEGF分泌。（D）通過CCK-8測試不同墊子上的HUVECs增殖。（E）用不同墊子培養的HUVECs的劃痕-傷口遷移試驗的代表性圖像。（F）在6h和24h時對四組HUVECs遷移率的定量分析。（G）第3天，用DAF-FM探針檢測不同墊子培養的HUVECs中細胞內NO生成的代表性熒光圖像。（H）四組中HUVECs的DAF-FM熒光強度的相對定量。用裸PCL墊培養的HUVECs中的DAF-FM熒光強度定義為100％。（I）使用Griess反應測定試劑盒檢測培養第3天由不同墊子培養的HUVECs釋放到培養基中的NO量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖5.PCL墊釋放的DMOG對調節巨噬細胞行為的影響。（A）用PCL和DMOG負載PCL墊培養3天的RAW 264.7細胞中HIF-1α蛋白表達的WB分析。（B）通過WB分析（A）定量RAW 264.7細胞的HIF-1α蛋白。（C）第3天，在有無DMOG負載的PCL墊上培養的RAW 264.7細胞的促炎和抗炎基因的相對表達。（D）用于分析受由不同墊子培養RAW 264.7細胞調節的HUVECs遷移的共培養實驗的示意圖。（E）12h后HUVECs細胞遷移測定的代表性圖像。（F）各組中HUVECs遷移的定量分析。（G）用于分析在不同墊子上培養的RAW 264.7細胞對SMCs功能蛋白標志物表達的調節作用的共培養實驗的示意圖。（H）通過WB分析與在不同墊子上生長3天的RAW 264.7細胞共培養的SMCs中的α-SMA和MYH蛋白表達。（I）通過WB分析定量SMCs中的α-SMA和MYH蛋白。*p<0.05，**p<0.01。
圖6.植入后7天PCL和PCL-1.6D移植物的HIF-1α蛋白表達和巨噬細胞極化。（A）代表性的彩色超聲圖像顯示了PCL和PCL-1.6D移植物的通暢性。（B）植入后7天兩種類型移植物中HIF-1α蛋白表達的WB分析。（C）基于蛋白質印跡分析定量植入移植物中的HIF-1α表達。（D）移植第7天，HIF-1α免疫組織化學染色橫截面的低放大率（左上圖）和高放大率圖像（圖1、2和3）。（E）使用CD68和CD206抗體對移植物橫截面進行免疫熒光染色以識別總巨噬細胞和M2巨噬細胞。（F至H）植入后1周，植入移植物的促炎基因（F），抗炎基因（G）和促再生基因（H）的相對表達。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖7.植入后1個月，評估移植物中的通暢性和炎癥反應。（A）肉眼可見移植物管腔表面上的毛細血管形成。紅色箭頭指向毛細管。（B）使用CD31抗體和DAPI免疫熒光染色法分析移植物壁內的毛細血管形成和細胞密度。（C和D）定量分析每個區域的細胞數（C）和毛細血管數（D）。每個樣品十張高倍率CD31和DAPI共染色圖像，每組五個樣品，以量化細胞密度和毛細血管密度。（E）立體顯微鏡圖像顯示PCL和PCL-1.6D移植物在植入1個月時無血栓和狹窄。（F）移植物中間區域橫截面的H＆E染色表明，與PCL移植物相比，PCL-1.6D移植物已經形成了完整的新生內膜。（G）移植物橫截面的代表性HIF-1α免疫組織化學染色圖像。插圖中顯示了較低的放大倍率圖像。（H）代表性CD68和CD206免疫熒光染色橫截面。（I和J）每個視野中CD68+細胞數（I）和CD206+細胞數（J）的定量分析。每個樣品十張高放大倍率CD68抗體或CD206抗體染色圖像，每組五個樣品，以量化CD68+細胞密度或CD206+細胞密度。
圖8.植入后1個月，移植物的內皮化和SMCs再生。（A）通過SEM觀察移植物在吻合部位、四分之一和中段的內皮覆蓋情況。（B）使用eNOS抗體對移植物的縱向切片進行免疫熒光染色以分析內皮化。（C）基于eNOS染色的內皮覆蓋率定量分析。（D）縱向切片的代表性α-SMA+抗體免疫熒光染色圖像。（E）對α-SMA+ SMCs覆蓋率的定量分析。（F）使用MYH+抗體對移植物的縱向切片進行免疫熒光染色以分析收縮性SMCs的覆蓋率。（G）橫截面的代表性MYH免疫熒光染色圖像。（H）用MYH+抗體對縱切面進行免疫熒光染色以定量分析收縮性SMCs的覆蓋率。（I）基于MYH+抗體免疫熒光染色法定量分析再生收縮性SMCs的面積。*p<0.05，***p<0.001。白色箭頭：血流方向；L：內腔；黃色箭頭：縫合部位。
微信二維碼
