DOI: 10.1016/j.actbio.2021.01.035
納米纖維支架因其模擬細胞外基質（ECM）結構而在組織工程中具有廣闊的應用前景。靜電紡絲技術因其易于制備納米纖維支架而被廣泛應用于各種組織工程領域。然而，當采用常規的支架制備方法和隨后的細胞接種時，由于這些支架中互連孔的尺寸較小，因此電紡納米纖維支架面臨著三維（3D）細胞分布的固有挑戰，這嚴重限制了它們在具有厚壁血管化結構的人體組織修復/再生中的應用。在這項工作中，研究者演示了一種通過同時進行乳液靜電紡絲和同軸細胞電噴涂將活的內皮細胞直接置于3D生物活性納米纖維支架內的方法。使用這種并行制造方法，將內皮細胞封裝在水凝膠微球中，并在支架制造過程中與含血管內皮生長因子（VEGF）的納米纖維一起沉積，從而形成具有3D嵌入式細胞封裝微球的納米纖維支架。在選擇性破壞水凝膠微球后，釋放出封裝的內皮細胞，從而產生具有組織樣3D細胞嵌入納米纖維結構的生物活性納米纖維支架。結果表明，在并行制造過程中，細胞存活率保持良好（>98％），并且在整個支架厚度上實現了深度細胞分布（約100μm）。3D細胞嵌入式架構結合了結構和生化線索，內皮細胞可以自由拉伸，顯示出增強的細胞間連接，維持了生物活性納米纖維支架的表型。綜上，本研究為構建具有3D細胞摻入的生物活性納米纖維支架和克服電紡納米纖維支架的固有問題提供了一種很有前途的平臺技術，這將為生物制造具有血管化結構和復雜解剖結構的仿生組織開辟了新的途徑。
圖1.示意圖顯示了并行的乳液靜電紡絲和同軸細胞電噴涂工藝，該工藝首先制備嵌入有細胞封裝微球的納米纖維支架，隨后在微球釋放封裝細胞后制備出摻入3D細胞的納米纖維支架。
圖2.通過同軸細胞電噴霧將內皮細胞封裝在海藻酸鈣水凝膠微球中。（A）以低細胞密度形成細胞封裝海藻酸鈣微球，通過使用LIVE/DEAD細胞生存力試劑盒對封裝細胞進行染色。（B）以高細胞密度形成細胞封裝海藻酸鈣微球，其中通過使用LIVE/DEAD細胞生存力試劑盒對封裝細胞進行染色。（C）以不同細胞密度形成的海藻酸鈣微球的平均直徑。（D）以低細胞密度形成的細胞封裝海藻酸鈣微球，其中封裝細胞分別用DAPI和DCFDA染色以標記細胞核并探測細胞內ROS水平。（E）以高細胞密度形成的細胞封裝海藻酸鈣微球，其中封裝細胞分別用DAPI和DCFDA染色以標記細胞核并探測細胞內ROS水平。（F）以不同細胞密度形成的海藻酸鈣微球中封裝細胞的活力。（G）以不同細胞密度形成的海藻酸鈣微球中具有高細胞內水平的細胞百分比。（H）以不同細胞密度形成的單個細胞封裝海藻酸鈣微球的細胞數量。（I）以不同細胞密度形成的海藻酸鈣微球的細胞包封能力。
圖3.海藻酸鈣微球按需釋放內皮細胞以及所釋放細胞的活性。（A）細胞釋放處理后，海藻酸鈣微球的結構隨時間的變化。（B）培養12小時后，分別用DAPI和DCFDA染色釋放的內皮細胞，以標記細胞核并探測細胞內ROS水平。（C）分析培養12小時后釋放細胞和人工接種細胞（對照）中每個細胞的DCFDA平均強度。（D）通過使用LIVE/DEAD細胞生存力試劑盒對在培養時間內釋放的內皮細胞進行染色。（E）在不同培養時間后分析釋放細胞的活性。（F）分析不同培養時間后釋放細胞的細胞密度。
圖4.通過同時乳液靜電紡絲和同軸細胞電噴霧制備的支架的形態、結構、力學性能和VEGF釋放曲線。（A）通過并行制造工藝制備的嵌入微球的支架的形態和結構。（B）通過并行制造和隨后的細胞釋放處理制備的3D細胞摻入支架的形態和結構。（C）比較正常PLGA支架，微球嵌入式支架和3D細胞摻入支架的極限拉伸強度。（D）比較正常PLGA支架，微球嵌入式支架和3D細胞摻入支架的斷裂應變。（E）乳液電紡PLGA納米纖維的核-殼介觀結構。（F）乳液電紡PLGA支架中VEGF的體外累積釋放曲線。
圖5.通過同時乳液靜電紡絲和同軸細胞電噴霧制備的生物活性納米纖維支架中內皮細胞的活性、分布、形態和細胞骨架發育。（A）HUVECs在微球嵌入支架中的生存力和分布（通過使用LIVE/DEAD生存力試劑盒染色），并在并行制造過程之后立即進行細胞染色。（B）HUVECs在3D細胞摻入支架中的生存力和分布（通過使用LIVE/DEAD生存力試劑盒染色），在并行制造過程和細胞釋放處理后立即進行細胞染色。（C）代表性LSCM圖像，顯示細胞培養1天后3D細胞摻入支架內HUVECs的3D分布（以鈣黃綠素AM標記）。（D）細胞培養1天后3D細胞摻入支架的形態，白色箭頭表示3D納米纖維結構中的內皮細胞充分拉伸。
圖6.在釋放VEGF的2D細胞摻入、無VEGF的3D細胞摻入和釋放VEGF的3D細胞摻入支架上或中培養的內皮細胞的細胞骨架發育和表型。（A）細胞培養3天后，在納米纖維支架上或中生長的內皮細胞的細胞骨架發育（無VEGF或釋放VEGF），白色箭頭指示形成的細胞間連接。（B）細胞培養5天后，在納米纖維支架上或中生長的內皮細胞的形態和表型（無VEGF或釋放VEGF）。
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