Biomacromolecules：表面功能化導電MEH-PPV:PCL納米纖維墊的制備及其對神經細胞行為的影響

DOI: 10.1021/acs.biomac.0c01445

在智能生物材料中加入對細胞有指導意義的化學和地形線索，并結合適當的物理刺激，可能有助于提高神經再生率。在這方面，研究者探索了基于聚[2-甲氧基-5-（2-乙基己基氧基）-1,4-亞苯基亞乙烯基]（MEH-PPV）的導電電紡納米纖維的表面功能化，并與外部施加的電刺激相結合以促進神經元的生長潛能。此外，還深入研究了納米纖維的電壓依賴性導電機制，以將其固有的導電性質與電刺激的神經元表達聯系起來。使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）和1,6-己二胺（HDA）替代昂貴的生物分子涂層（例如膠原蛋白）進行表面功能化，從而實現細胞粘附。納米纖維均勻、多孔、導電、機械強度高并且在生理條件下是穩定的。表面胺化可增強生物相容性、3T3細胞粘附和擴散，而神經元模型大鼠PC12細胞系在表面功能化墊上表現出比非功能化墊更好的分化。當與電刺激（ES）結合使用時，這些墊子顯示出與無ES條件的膠原蛋白涂層墊子相當或更快的神經突起形成和延伸。研究結果表明，表面胺化結合ES可以為使用MEH-PPV基神經支架提供更快的神經再生。

圖1.本報告中所執行的工作計劃。靜電紡絲MEH-PPV和聚己內酯（PCL）共混物以產生納米纖維支架，然后進行表面官能化以賦予氨基官能團，從而使其具有生物活性。評估成纖維細胞在功能化納米纖維上的活性以確認其生物活性，然后對PC12細胞進行低水平電刺激以評估其作為神經支架的潛力。納米纖維固有的電壓依賴性導電機理與改善的神經突發育相互關聯。

圖2.（A）在10K放大倍率下以四種體積比靜電紡絲制備的不同MEH:PPV:PCL納米纖維的掃描電子顯微照片（比例尺=4μm），如圖所示。在150K放大倍率下獲得的插圖（比例尺=400nm）。（B）不同MEH:PPV:PCL納米纖維的XRD圖譜，如圖所示，以及最能描述其衍射圖的XRD曲線的Voigtian擬合。

圖3.（a）未官能化和官能化MEH-PPV:PCL電紡納米纖維的I-V特性和（b）Kaiser擬合（正向偏置）。

圖4.（A）原始和功能化電紡墊的應力-應變行為；（B）剛度常數（E）和極限拉伸強度（UTS）。

圖5.原始和功能化MEH-PPV:PCL納米纖維在生理環境下的穩定性研究。（A）在中性磷酸鹽緩沖液中孵育45天期間的質量損失曲線；（D）纖維直徑的變化；（E）與PBS孵育前后，納米纖維墊薄層電阻（Rs）的變化。

圖6.用（A）APTES和（B）HDA功能化前后，MEH-PPV:PCL電紡納米纖維的振動光譜。

圖7.（A）XPS全掃描結果顯示原始的和功能化MEH-PPV:PCL電紡納米纖維的表面元素組成。（B）MP20:80，（C）AFMP20:80和（D）HFMP20:80的C1s XPS光譜的峰解卷積。

圖8.FT-IR和XPS分析表明，PCL與APTES（方案I）和HDA（方案II）相互作用的擬議方案。

圖9.FT-IR和XPS分析表明，MEH-PPV與APTES（方案III）和HDA（方案IV）相互作用的擬議方案。

圖10.培養24小時后，原始和功能化MEH-PPV:PCL電紡墊上的（A）3T3和（B）PC12細胞活性（-ve對照：TCP和+ve對照：馬來酸叔丁酯）。細胞活性百分比表示為平均值±S.D.，n=4。*和＃分別表示原始墊和功能墊在p≤0.01和p≤0.05時的統計學顯著性。

圖11.（A）用鈣黃綠素AM（綠色），EthD-1（紅色）和DAPI（藍色）染色的帶有相襯覆蓋物的3T3成纖維細胞的活死成像數據（比例尺=75μm）；（B）細胞擴散百分比的定量分析；（C）24和48小時后，原始和功能化MEH-PPV:PCL墊上的細胞面積（單個細胞的平均面積）。（B）和（C）中的數據為平均值±S.D.，n=6。*和＃分別表示p≤0.01和p≤0.05時的統計學顯著性。

圖12.在非功能化和功能化MEH-PPV:PCL電紡墊上生長72小時的3T3成纖維細胞的形態（比例尺=20μm）。插圖顯示帶有絲狀偽足/板狀偽足樣延伸的放大圖像（比例尺=10μm）。

圖13.（A）在分化條件下培養7天的PC12細胞的微管蛋白免疫染色，在不同MEH-PPV:PCL墊上用DAPI復染，如圖所示。神經元胞體用白色箭頭表示，而紅色箭頭表示帶有細長和分支神經突的神經元，其中包含或不包含生長錐（比例尺=75μm）。神經突發育和延伸的定量表現為（B）具有神經突的細胞百分比和（C）每個細胞的神經突長度（平均神經突長度）。*和＃分別表示原始墊在p≤0.01和p≤0.05時的統計學顯著性。

圖14.如圖所示，在不同MEH-PPV:PCL墊上生長1周的PC12細胞的SEM圖像。紅色箭頭表示神經突在不同電紡墊上的突出部分。比例尺=5μm。

圖15.（A）未經電刺激和經電刺激的PC12細胞在表面功能化和膠原蛋白涂覆MEH-PPV:PCL墊上長達1周的Beta（III）免疫染色（比例尺=75μm）。定量分析結果顯示（B）帶有神經突的細胞百分比，（C）每個細胞的神經突，（D）每個細胞的神經突長度，以及（E）在有ES和無ES的不同導電墊上分化的PC12細胞的中位數神經突長度。數據為平均值±S.D.，*和＃分別表示p≤0.01和p≤0.05時的統計學顯著性。

圖16.生物材料固有電導率對神經突發育和生長的影響。（A）在功能化和膠原蛋白涂覆MEH-PPV:PCL墊上（A）帶有神經突的細胞計數和（B）平均神經突長度相對于其固有低場電導（Go）值的變化。