DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.12.152
功能性肌腱組織工程依賴于利用天然肌腱細胞外基質的生化和生物物理學線索。在本研究中，通過同軸穩定射流靜電紡絲法制備了高度定向的聚L-乳酸（PLLA）纖維，其表面修飾有兩種重要的肌腱ECM成分，即I型膠原（COL1）和硫酸軟骨素（CS）。研究了仿生COL1-CS（殼）/PLLA（核）纖維對人間充質干細胞（hMSCs）體外成肌腱分化的影響。與普通的PLLA纖維相比，在定向COL1-CS/PLLA纖維上觀察到了更高的細胞擴散和增殖速率。肌腱相關基因Scleraxis（SCX）和COL1以及蛋白質Tenomodulin（TNMD）的表達顯著增加。機械刺激的引入對hMSCs成肌腱分化具有協同作用。在COL1-CS/PLLA纖維基底上觀察到細胞中TGF-β2、TGFβR-II和Smad3的更高表達，這表明COL1-CS/PLLA超細纖維可通過激活TGF-β信號通路調控hMSC的成肌腱分化。在大鼠跟腱修復模型中進行的動物研究證實了COL1-CS/PLLA對肌腱組織再生的促進作用。因此，該研究所制備的高度定向仿生纖維可以作為功能性肌腱再生的高效支架系統。
圖1.實驗設計的流程圖。
圖2.纖維支架的表征。定向纖維的SEM顯微照片：（A）非交聯COL1-CS/PLLA（插圖為TEM圖像，顯示帶有白色虛線的核-殼結構）和（B）PLLA。分析纖維支架和天然大鼠跟腱的拉伸特性，包括典型的應力-應變曲線（C），拉伸強度（D），楊氏模量（E）和斷裂應變（F）。**p＜0.01，n≥3。
圖3.（A，B）培養3天后，通過鬼筆環肽染色在定向COL1-CS/PLLA（A）和PLLA（B）纖維支架上的hMSCs細胞骨架。比例尺=100μm。（C）在不同纖維支架上培養的hMSCs的面積和半徑比。（D）通過MTS測定分析在不同纖維支架上培養的hMSCs的細胞增殖。**p＜0.01，***p＜0.001，n=3。
圖4.在培養的第3天和第10天通過RT-PCR測定肌腱相關標志物SCX、TN-C、COL1和COL3，骨相關標志物RUNX2和TGF-βs（TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3）的mRNA轉錄產物表達水平。在第4天至第10天期間施加機械刺激。*p＜0.05，**p＜0.01，n=3。
圖5.（A）在培養的第3天和第10天，在PLLA和COL1-CS/PLLA纖維支架上用DAPI染色的細胞核（藍色）對hMSCs中的TNMD（綠色）進行免疫熒光標記。（B）在培養的第3天和第10天，PLLA和COL1-CS/PLLA纖維支架上TNMD陽性細胞的百分比。在第4天至第10天期間施加機械刺激。*p＜0.05，**p＜0.01，n=6，比例尺=100μm。（要解釋此圖例中對顏色的引用，請參閱本文的網絡版本。）
圖6.（A）通過全細胞裂解物的蛋白質印跡分析hMSCs的TGF-β信號分子（±表示有/沒有COL1-CS涂層），（B）用含或不含TGFβR-II抑制劑的LY2109761處理的COL1-CS/PLLA上細胞蛋白質提取物的蛋白質印跡分析。
圖7.（A）造成了一道傷口縫并移除跟腱，以產生6mm長的缺損。將支架放置在肌腱缺損處并縫合。（B）術后4或8周，修復部位的正常對照（右圖為左圖方框區的高倍放大）、PLLA和COL1-CS/PLLA的典型H＆E染色。比例尺=50μm，“正常”是指天然的大鼠跟腱。
圖8.植入8周后，來自再生肌腱的肌腱相關基因的mRNA轉錄水平。*p＜0.05，**p＜0.01，n=6，“正常”是指天然的大鼠跟腱。
圖9.（A）術后8周，正常對照、PLLA和COL-CS/PLLA中表達的特殊蛋白（Col1，Col3）的免疫組織化學染色。比例尺=50μm。（B）再生8周后修復肌腱的力學性能。*p＜0.05，**p＜0.01，n≥3，“正常”是指天然的大鼠跟腱。
圖10.所提出的機理模型表明，COL1-CS/PLLA纖維增加了內源性TGF-β2的產生，激活TGF-β信號上調SCX的表達，從而增加了hMSCs的腱鞘生成。
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