Mater. Sci. Eng. C：納米金剛石薄膜涂覆SiOx亞微米纖維網的制備及其對人成骨樣Sao

DOI:10.1016/j.msec.2020.111792

本研究構建了一種具有分層亞微米-納米結構的獨特納米金剛石基復合多孔材料，用于骨組織工程。該材料由靜電紡絲氧化硅（SiOx）制備的亞微米纖維組成，經氧封端（O-SiOx），并密封涂覆有納米金剛石（NCD）薄膜。然后用氫（H-NCD）或氧（O-NCD）封端NCD膜。將這些材料作為人成骨樣Saos-2細胞粘附、生長和成骨分化的基質進行了測試。NCD涂層樣品的初始粘附細胞數量和擴散面積、接種后7天的生長速率以及堿性磷酸酶（ALP）活性均明顯高于未涂覆的O-SiOx樣品。此外，O-NCD涂層樣品細胞中的I型膠原蛋白濃度顯著高于裸O-SiOx樣品。觀察到的差異可歸因于NCD的可調潤濕性，以及NCD涂層樣品與裸SiOx表面（不穩定且快速侵蝕）相比更適合的表面形貌。H-NCD涂層和O-NCD涂層均促進了Saos-2細胞的相似初始粘附，但隨后的細胞增殖活性要屬O-NCD涂層樣品更高。與H-NCD涂層樣品相比，O-NCD涂層樣品細胞中的β-肌動蛋白、紐蛋白、I型膠原和堿性磷酸酶（ALP）濃度、ALP活性以及鈣沉積趨向更高，盡管這些差異未達到統計學顯著性。O-NCD涂層樣品的細胞性能提高可歸因于這些樣品的更高潤濕性（水滴接觸角小于10°），而H-NCD涂層樣品則具有疏水性（接觸角大于70°）。因此，可以將NCD涂覆多孔SiOx網視為骨組織工程的合適支架材料，尤其是那些具有O封端NCD涂層的支架。

圖1.靜電紡絲后的SiOx纖維膜（A），氫封端（H-NCD B）和氧封端（O-NCD C）后的金剛石涂層膜的代表性SEM圖像。插圖顯示更高的放大倍率圖像。

圖2.CVD工藝后，SiOx纖維墊（A，B）和金剛石涂覆平面Si基板（C，D）的代表性AFM圖像。掃描尺寸為10×10μm2（左）和1×1μm2（右）。

圖3.多孔金剛石膜（NCD膜）和SiOx網格的拉曼光譜。

圖4.初始疏水性SiOx纖維墊（A），親水性O封端SiOx纖維墊（O-SiOx B）和CVD工藝之后的金剛石膜（C）的照片。

圖5.（A）原始SiOx納米纖維，（B）氧封端纖維墊（O-SiOx的親水表面，接觸角小于2°），（C）氫封端金剛石膜（即接觸角約為73°的疏水性表面）和（D）氧封端金剛石膜（即接觸角小于10°的親水性表面）的潤濕特性。（E）每種樣品平均接觸角值的圖形說明（n=6，誤差線顯示標準偏差）。

圖6.Saos-2細胞接種到H-NCD（A）和O-NCD（B）涂層膜、裸O-SiOx膜（C）以及顯微鏡蓋玻片（D）上第1天的β-肌動蛋白免疫熒光染色。細胞核用DAPI復染。Leica DMi 8熒光顯微鏡，干燥的N-Plan 40x物鏡，Chroma 39000和39002濾光片。比例尺=20μm。

圖7.Saos-2細胞接種到H-NCD或O-NCD涂層膜、裸O-SiOx膜和顯微鏡蓋玻片上第1、4和7天的細胞群體密度（A），接種到不同材料上第1天的細胞擴散面積（B），細胞周長（C）和細胞圓度（D）。對于每種類型的樣品，數據表示為8-12個顯微鏡場的平均值±SD（A，B）和126-896個細胞的中值±IQR（C，D）。采用ANOVA（A，B）和Kruskal-Wallis單因素方差分析（B，D）進行統計學分析。統計學顯著性：（p<0.05）與上述所有樣品相比。

圖8.Saos-2細胞接種到H-NCD（A）和O-NCD（B）涂層膜、裸O-SiOx膜（C）和顯微鏡蓋玻片（D）上第7天的種群密度。細胞核用DAPI染色。Leica DMi 8熒光顯微鏡，物鏡5x/0.12，比例尺=200μm。

圖9.Saos-2細胞接種到H-NCD（A1-A3）和O-NCD（B1-B3）涂層膜、裸O-SiOx膜（C1-C3）和顯微鏡蓋玻片（D1-D3）上第4天的紐蛋白和F-肌動蛋白染色。A1-D1：通過免疫熒光染色的紐蛋白，A2-D2：用TRITC-鬼筆環肽染色的F-肌動蛋白，A3-D3：兩種圖像的合并。Carl Zeiss LSM 880 NL共聚焦顯微鏡（德國），比例尺=20μm。

圖10.Saos-2細胞接種到H-NCD（A1-A3）和O-NCD（B1-B3）涂層膜、純O-SiOx膜（C1-C3）和顯微鏡蓋玻片（D1-D3）上第7天的骨鈣素和F-肌動蛋白染色。A1-D1：通過免疫熒光染色的骨鈣素，A2-D2：用TRITC-鬼筆環肽染色的F-肌動蛋白，A3-D3：兩種圖像的合并。Leica DMi 8熒光顯微鏡，10x/0.25物鏡，Chroma 39000、39002和39004濾光片。比例尺=100μm。

圖11.Saos-2細胞接種到H-NCD和O-NCD涂層膜、裸O-SiOx膜和顯微鏡蓋玻片上第7天的β-肌動蛋白（A）和紐蛋白（B）濃度。由ELISA進行測定。吸光度以對照玻璃上數值的百分比形式給出。3至7次獨立測量的均值+S.E.M.。單向方差分析和Student-Newman-Keuls方法。

圖12.Saos-2細胞接種到H-NCD和O-NCD涂層膜、裸O-SiOx膜和顯微鏡蓋玻片上第7天的I型膠原蛋白（A）和ALP（B）濃度，ALP活性（C）和骨鈣素濃度（D）。A，B，D：通過ELISA測量。吸光度以對照玻璃上數值的百分比形式給出。C：PNP是對硝基苯基磷酸酯水解的產物。3至7次獨立測量的均值+S.E.M.。單向方差分析和Student-Newman-Keuls方法。統計學顯著性：（p<0.05）與上述所有樣品相比。

圖13.接種后第14天和第21天，生長在O-NCD或H-NCD涂層膜、裸O-SiOx膜以及顯微鏡蓋玻片上的Saos-2細胞的鈣沉積。單向方差分析和Student-Newman-Keuls方法。3至8次獨立測量的平均值±標準偏差。

圖14.天然SiOx和NCD涂覆SiOx網格的應力-應變曲線。