DOI:10.1016/j.apmt.2020.100888
種植體相關感染（IRIs）和種植體骨整合障礙是全關節置換術（TJA）后最常見的災難性并發癥。巨噬細胞在這些并發癥的發生中起著至關重要的作用。在此，針對IRIs和種植體骨整合障礙的免疫學特征，研究者提出了一種序貫免疫調節策略來應對該類并發癥，使用由簡便的靜電紡絲工藝和熱壓法合成的Cu-Zn雙層納米纖維膜。結果表明，Cu-Zn雙層納米纖維膜具有良好的Cu2+和Zn2+的受控釋放，并且可以通過交替激活MAPK和mTOR信號通路依次調節從M1到M2的巨噬細胞表型轉變。此外，雙時態雙向免疫調節作用賦予了Cu-Zn雙層納米纖維膜在體外和體內優異的抗感染和成骨能力。這是第一種專門針對IRIs和種植體骨整合障礙的免疫要求而設計的雙時態雙向免疫調節生物材料。本研究工作是一次有意義的嘗試，為探索新型免疫調節生物材料以解決臨床挑戰開辟了新的途徑。
圖1.Cu-Zn雙層納米纖維膜的形態表征、元素分布和離子釋放行為。（a）0，（b）Zn，（c）Cu和（d）Cu-Zn雙層納米纖維膜上層和下層的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。在EDS映射分析條件下的SEM圖像以及Cu-Zn雙層納米纖維膜（e）上層和（f）下層的相應EDS映射結果。每隔24小時，Tris-HCl緩沖液中（g）0，（h）Zn，（i）Cu，（j）Cu-Zn雙層納米纖維膜釋放的Cu2+和Zn2+濃度。注：0：含明膠膜（Gel）和PCL膜（PCL）的雙層納米纖維膜；Zn：含Gel和鋅黃長石負載PCL膜（ZnPCL）的雙層納米纖維膜；Cu：含銅硅鈣石負載明膠膜（CuGel）和PCL的雙層銅纖維膜；Cu-Zn：含CuGel和ZnPCL的雙層納米纖維膜。
圖2.不同雙層納米纖維膜對RAW264.7巨噬細胞的免疫調節作用。（a）在不同5天和11天樣品的提取物中培養的RAW264.7的免疫熒光染色：綠色（iNOS，M1巨噬細胞標記物），紅色（Arg-1，M2巨噬細胞標記），藍色（DAPI）。（b）通過流式細胞儀分析的RAW264.7表面標記物CCR7（M1巨噬細胞標記物）和CD206（M2巨噬細胞標記物）的代表性散點圖。（c，d）通過流式細胞儀檢測到的CCR7和CD206陽性RAW264.7巨噬細胞的定量結果。（e，f）CCR7和CD206的RT-PCR分析結果。注：與0組相比，**P<0.05，***P<0.01和***P<0.001；與Zn組相比，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001；與Cu組相比，＆P<0.05，&&P<0.01和&&&P<0.001。
圖3.Cu-Zn雙層納米纖維膜對RAW264.7巨噬細胞免疫調節機制的蛋白質組學分析。（a，c）分別對5天和11天的Cu-Zn雙層納米纖維膜的蛋白質組學結果進行火山圖分析。在iTRAQ量化項目中，總共鑒定出40,511個肽和6533個蛋白質，錯誤發現率（FDR）為1％。選擇折疊變化＞1.2且Q值＜0.05作為差異表達的顯著閾值。紅色和綠色點分別代表顯著上調和下調的蛋白質，而黑色點代表無顯著差異表達的蛋白質（DEPs）。（b，d）在（b）5天和（d）11天的比較組中，DEPs的KEGG途徑富集統計數據。顯示排名前10的路徑術語。縮寫：AD：阿爾茨海默病；OP：氧化磷酸化；RES：逆行內源性大麻素信號；MA：礦物質吸收；NAFLD：非酒精性脂肪肝；MP：代謝途徑；PD：帕金森病；Ri：核糖體；Ph：吞噬體；TDM：I型糖尿病；PGI：戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化；En：內吞作用；ALS：肌萎縮性側索硬化；NA：尼古丁成癮；PM：苯丙氨酸代謝；PEI：致病性大腸桿菌感染；α-LAM：α-亞麻酸代謝；PM：丙酮酸代謝；Al：酒精中毒。（e）由Cu-Zn雙層納米纖維膜引起的巨噬細胞表型轉換的可能機制示意圖。
圖4.使用IVIS系統測量體內不同雙層納米纖維膜的抗菌性能。（a）第0、1、4、7、10和13天小鼠背部的代表性生物發光偽彩色照片。顏色條顯示細菌性PI的強度（p/s/cm2/sr）。（b）各組小鼠背部細菌性PI的時程。注：與Cu-Zn組相比，P<0.05，P<0.01和P<0.001；與Cu組相比，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001；與0組相比，＆P<0.05，&&P<0.01和&&&P<0.001。
圖5.體內不同雙層納米纖維膜抗菌作用的系統評價。（a）術后第14天對種植體周圍軟組織的一般觀察和組織學評估。藍色箭頭標記種植體周圍軟組織中的膿液和壞死組織；紅色熒光指示相應的免疫熒光染色切片中滲入的中性粒細胞；紅色箭頭指示相應的吉姆薩染色部分中的細菌殘留。（b）在體內的四個種植體上生物膜形成的一般觀察和SEM結果。藍色箭頭標記種植體上已形成的生物膜和細菌。（c）第14天，對種植體中細菌負擔的定量分析結果。（d）手術后第5天和第11天，對四組種植體周圍軟組織的組織切片進行免疫熒光染色。綠色（iNOS，M1巨噬細胞標記物），紅色（CD206，M2巨噬細胞標記物）和藍色（DAPI）。注：與0組相比，*P<0.05和***P*0.001；與Zn組相比，###P<0.001；與Cu組相比，&&&P<0.001。
圖6.不同雙層膜直接抗菌機制的研究。（a）定性和定量分析水溶液中不同膜產生的ROS的水平。（b）細菌形態的SEM結果。紅色箭頭表示細菌含受損的細胞壁或膜。（c）兩種菌株生物膜結構的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）結果。生物膜中的死菌被染成紅色，而活菌被染成綠色。（d，e）兩種菌株生物膜中eDNA水平的定性和定量分析。注：與0組相比，***P<0.001；與Zn組相比，###P<0.001。
圖7.系統評估巨噬細胞介導不同組對金黃色葡萄球菌的抗菌作用。（a）通過Operetta CLS檢測到的用不同雙層納米纖維膜處理的RAW264.7巨噬細胞抗菌作用的CLSM結果。綠色（RAW264.7-GFP），紅色（金黃色葡萄球菌“ST1792-mCherry”）和藍色（Hoechst 33,342）。（b，c）不同樣品條件的巨噬細胞的殺菌能力的定性和定量結果。（d，e）不同樣品條件的巨噬細胞吞噬作用的定性和定量結果。注：與0組相比，*P<0.05和***P*0.001；與Zn組，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001；與Cu組相比，＆P<0.05和&&P<0.01。
圖8.在5天和11天巨噬細胞條件培養基中體外培養14天的rBMSCs的成骨分化評估。（a）rBMSCs的堿性磷酸酶（ALP）染色。（b，c）rBMSCs中ALP和骨鈣蛋白（OCN）的基因表達分析。（d）rBMSCs的OCN免疫熒光染色。綠色（OCN），紅色（肌動蛋白）和藍色（DAPI）。注：與0組相比，**P<0.05，***P<0.01和***P<0.001；與Zn組相比，##P<0.01和###P<0.00；與Cu組相比，＆P<0.05和&&P<0.01。
圖9.大鼠種植體相關骨修復模型的成骨評估。（a）放射成像的經軸、矢狀、冠狀和3D重建Micro-CT圖像。紅線和藍線指示相應的冠狀截面圖像的切割平面，黃色箭頭標記種植體周圍的新骨。（b-e）Micro-CT數據的定量分析：骨體積/總體積（BV/TV），小梁厚度（Tb.Th），小梁數目（Tb.N）和松質骨密度（BMD）。（f）未脫鈣切片的茜素紅S（紅色），鈣黃綠素（綠色）和Van Gieson（VG）染色。注：白色菱形表示種植體，白色箭頭標記組織-種植體的界面。與0組相比，*P<0.05和**P<0.01；與Zn組相比，#P<0.05和##P<0.01；與Cu組相比，＆P<0.05和&&P<0.01。
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