DOI:10.3390/pr8111341
由創傷、癌癥治療或感染引起的骨損傷是一項重大且日益嚴重的全球性挑戰。人口老齡化這一社會現象在其中起著關鍵作用，因為越來越多的骨折是由于骨質疏松癥等疾病引起的，而這類疾病也給醫療保健系統帶來了沉重的負擔。當前的修復策略沒有充分考慮健康組織中發現的細胞-底物相互作用，因此，需要更復雜的模型來對其進行完善。體外3D微環境的創建是一種新興的以地形為導向的方法，它提供了將細胞遷移和分化機制的知識應用于創建新細胞底物的機會。此外，在體外骨再生模型中引入生物功能劑在一定程度上控制了細胞走向成骨途徑的命運。在這項研究中，應用了三種方法來對空間受限的電紡人工微環境進行功能化，這些微環境呈現出天然骨干細胞巢的相關成分。在細胞外基質（ECM）蛋白（I型膠原蛋白）、糖胺聚糖（肝素）和陶瓷基材料（生物玻璃）功能化的電紡微加工支架上研究了間充質干細胞（MSCs）的生物學和成骨行為。在不改變聚己內酯（PCL）支架提供的纖維結構的前提下，成功地將膠原蛋白、肝素和生物玻璃（BG）納入模型中。間充質干細胞（MSCs）成功植入所有生物功能支架中，當暴露于PCL/BG復合材料中時，堿性磷酸酶生成量增加。這項研究證明了制備智能化分層人工微環境以研究干細胞行為的可行性，并最終證明了將這些人工微環境整合到多功能膜中以進行骨組織再生的潛力。
圖1.干細胞微環境的總體視圖，顯示了關鍵特征，細胞類型位置，并突出顯示了（綠色）在這項工作中要研究的特定組件（物理和離散空間的制備以及細胞外基質（ECM））和礦物質成分（生物玻璃，BG）的生物功能化）。
圖2.示意圖突出顯示了形貌可控電紡基材的制備方法，并總結了用于修飾電紡微環境膜的生物功能化策略。
圖3.靜電紡絲支架的掃描電子顯微照片：（a）聚己內酯（PCL）電紡網和裸樣的掃描電子顯微鏡（SEM）；（b）PCL電紡微環境樣品的SEM顯示出完整的生態位結構，其周圍為平坦區域；（c）PCL電紡纖維隨機分布在普通支架中；（d）掃描電鏡照片顯示了生態位結構內纖維分布的不同模式；（e）BG粉末的SEM顯微照片，顯示在同一樣品中研磨后的BG顆粒具有不規則的粗糙表面和可變的粒徑；（f）帶有BG的電紡裸樣，箭頭指示BG顆粒出現在隨機取向纖維結構內；（g）帶有BG的電紡微環境樣品，圓圈顯示微環境的邊緣；（h）帶有BG的PCL電紡微環境樣品的高倍放大，箭頭指示BG顆粒出現在定向纖維結構內。
圖4.電紡支架纖維的SEM分析及其排列對細胞形態的影響：（a）靜電紡絲支架中合成生態位的SEM顯微照片；（b-d）SEM圖像顯示了微環境內不同的纖維截面，具體是：（b）微環境外的隨機取向纖維區域；（c）微環境壁中的定向纖維；（d）微環境底部的隨機取向纖維區域；（e）以直方圖的形式分析微環境不同部分內的纖維排列；（f）在更多隨機纖維上生長的rMSCs的形態；（g）在更多定向纖維上生長的rMSCs的形態。
圖5.PCL/BG裸樣的SEM顯微照片，顯示了BG濃度對纖維形態和直徑測量的影響：（a）PCL/0％BG；（b）PCL/10％BG；（c）PCL/30％BG；使用顯示尺寸分布的直方圖分析靜電紡絲支架的纖維直徑；柱狀圖顯示BG濃度對PCL/BG溶液平均粘度的影響；（f）條形圖顯示BG濃度對纖維直徑的影響。
圖6.將膠原蛋白沉積到靜電紡絲支架上，并用MSCs培養14天：（a）表面沉積有膠原蛋白的裸樣的SEM圖像。使用Photoshop將膠原蛋白標為藍色；（b）沉積在電紡支架微環境中的膠原的SEM圖像。膠原蛋白為藍色；（c）對照支架的天狼星紅染色和膠原沉積支架的紅色染色，表明存在膠原；（d）基于在有無微環境和膠原蛋白的靜電紡絲支架上對rMSC細胞進行14天的培養，由PrestoBlue?分析得出的細胞代謝數據。在任何條件下，使用方差分析均未發現統計學差異；（e）在無膠原蛋白的普通支架上對rMSC細胞進行14天的培養，其細胞核DAPI染色的熒光圖像（藍色）；在含膠原蛋白（偽粉色）的普通支架上對rMSC細胞進行14天的培養，其細胞核DAPI染色的熒光圖像（藍色）。
圖7.將肝素沉積到電紡支架上，并用rMSCs培養14天：（a）表面沉積有肝素的普通支架的SEM圖像；（b）肝素沉積到微環境中的SEM圖像；（c）熒光肝素（綠色）沉積在無微環境的電紡支架上的熒光圖像；（d）熒光肝素（綠色）沉積到含微環境的電紡支架上的熒光圖像；（e）普通肝素涂覆支架和對照的甲苯胺藍染色；（f）基于在有無微環境和肝素的電紡支架上對rMSC細胞進行14天的培養，由PrestoBlue?分析得出的細胞代謝數據。在任何條件下，使用方差分析均未發現統計學差異，數值為平均值±SD（N=1，n=3）；（g）在無肝素的普通支架上對rMSC細胞進行14天的培養，其細胞核DAPI染色的熒光圖像（藍色）；（h）在普通支架上對rMSC細胞進行14天的培養，其細胞核DAPI染色（藍色）和肝素熒光（綠色）的熒光圖像。
圖8.BG功能化支架上的細胞形態和分布：（a）含10％BG的普通樣品的細胞核DAPI染色（藍色）的熒光顯微鏡圖像；（b）含10％BG的微環境樣品的細胞核DAPI染色（藍色）的熒光顯微鏡圖像；（c）30％BG普通樣品的SEM顯微照片；（d）含10％BG的微環境樣品的SEM顯微照片；（e）10％BG微環境的共聚焦顯微鏡圖像；（f）30％BG微環境底部的共聚焦顯微鏡圖像；（g）10％BG普通樣品的共聚焦顯微鏡圖像；（h）微環境結構的共聚焦顯微鏡熱圖，每種顏色表示細胞穿透的特定深度。據觀察，細胞在微環境的中心（紅色區域）穿透了180μm的深度，而在微環境的邊緣它們表現出表面膨脹（藍色區域）。
圖9.BG功能化支架的生物學評估。ALP分析圖片：（a）裸樣0％BG；（b）微環境樣品0％BG；（c）裸樣10％BG；（d）微環境樣品10％BG；（e）裸樣30％BG；（f）微環境樣品30％BG；（g）通過計算光學圖像中污漬覆蓋率而獲得的微環境樣品的ALP定量；（h）基于比較實驗第1天和第14天之間膜設計和組成的影響，由PrestoBlue?分析得出的細胞代謝數據。
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