Biomater. Sci.：絲素蛋白納米纖維墊可用于皮膚傷口中氧化應激的可視傳感

DOI: 10.1039/D0BM01325K

傷口愈合是一個重要的臨床問題，研究人員正在不斷探索如何促使傷口盡早愈合并提高其恢復能力。雖然傷口愈合的病因是多因素的，但是高度炎癥和增加的氧化應激會導致慢性炎癥、內皮功能障礙和膠原蛋白降解，從而延緩了整個愈合過程。因此，對氧化應激的可視傳感在成功實施基于特定要求的傷口愈合療法方面是非常有用的。在這項研究中，采用靜電紡絲法制備了絲素蛋白納米纖維墊，并注入了能夠檢測到過氧化氫（一種活性氧分子）的Amplex Red。當H2O2濃度為1μM時，這些墊子在檢測限下產生了可見的顏色變化。在有受損傷口的糖尿病小鼠中進行的體內研究顯示，在24小時內注入Amplex Red的墊子的顏色發生了明顯變化。這些注入Amplex的電紡絲素蛋白納米纖維墊具有增強傷口愈合療法的潛力。

圖1：在過氧化物酶和H2O2存在下，Amplex Red氧化為可見顏色產物的示意圖。在過氧化物酶存在下，Amplex Red試劑與H2O2的相互作用導致其氧化成可見的粉紅色化合物Resorufin。在此，該反應在含有Amplex Red和過氧化物酶相互作用的小瓶保持無色的狀態下進行。但是，添加的H2O2會導致Amplex Red瞬間氧化成高度可見的粉紅色Resorufin化合物。

圖2：通過脫膠過程和增溶作用，從生絲繭中制備絲素蛋白的示意圖。絲素蛋白溶液的靜電紡絲可形成納米纖維絲素蛋白墊。

圖3：使用掃描電子顯微鏡（SEM）對含有和不含有復合物的電紡絲素蛋白納米纖維墊進行了表征。SEM分析表明連續的絲素蛋白納米纖維的形成導致電紡絲素蛋白墊的合成。A）代表納米纖維絲素蛋白墊，而B）代表注入Amplex Red的納米纖維絲素蛋白墊。在這兩種絲素蛋白墊中均可以觀察到超細連續納米纖維的形成。C）顯示了使用ImageJ分析每個樣品中10種不同納米纖維的納米纖維尺寸測量的條形圖（來自SEM圖像）。添加Amplex Red對納米纖維的直徑沒有任何顯著影響。D）還對絲素蛋白墊和注入Amplex Red的絲素蛋白墊進行了FTIR分析。酰胺區域峰的存在范圍為1600 cm-1、1500 cm-1和1200 cm-1，表明存在絲素蛋白的無規卷曲和β-折疊構象以及納米纖維的水穩定性。在2900 cm-1、2800 cm-1、1000 cm-1和950 cm-1區域還存在其他特定峰，表明Amplex Red化合物已注入納米纖維絲素蛋白墊中。（R）代表絲素蛋白的無規卷曲構象，而（B）代表絲素蛋白的β-折疊構象帶。

圖4：正在測試注入Amplex Red化合物的絲素蛋白納米纖維墊，作為視覺檢測H2O2的概念證明。A）代表對照（絲素蛋白墊）和注入Amplex的絲素蛋白墊（厚墊的厚度約0.0043mm，薄墊的厚度約0.001mm）。厚和薄納米纖維絲素蛋白墊可通過將Amplex Red氧化為Resorufin而有效地顯示出粉紅色。B）代表用于進一步傳感測量的電紡絲素蛋白墊的尺寸。這些尺寸為1x0.5cm（長x高），用于傳感測量。C）用2種不同濃度的H2O2和HRP處理注入Amplex的絲素蛋白墊，其濃度相差100倍。左上角顯示了一個對照墊，用于進行顏色對比。經過氧化氫處理后，墊子可以有效地顯示可見的顏色。D）對照絲素蛋白墊、注入Amplex的絲素蛋白墊和注入Amplex的絲素蛋白墊的表面元素分析，其通過Amplex Red成分的氧化而發生顏色變化。全掃描光譜（i）絲素蛋白墊，（ii）注入Amplex的絲素蛋白墊：未氧化，以及（iii）注入Amplex的絲素蛋白墊：氧化。各絲素蛋白墊的C 1s光譜以及實驗光譜的反褶積，其峰對應于C-C/C=C、C-N、C-O和C=O的結合能。給出了擬合光譜和實際光譜。

圖5：使用人皮膚角質形成細胞（HaCat），通過MTT分析測定細胞活性，對Amplex Red化合物進行細胞生物相容性分析。細胞活性超過80％被認為具有生物相容性。使用不同濃度的Amplex Red化合物，當進行A）24小時和B）48小時細胞生物相容性測試時，濃度高達388 μM具有高度生物相容性。

圖6：用固定濃度的HRP和濃度范圍為1 mM至1μM的不同濃度的H2O2處理的對照和注入Amplex的絲素蛋白墊，通過ImageJ軟件對顏色強度的變化進行量化，找到絲素纖維蛋白墊的檢測限值。A）在30分鐘、24小時和48小時的時間點，在25μg/mL的固定HRP濃度和不同H2O2濃度下的對照組和注入Amplex的絲素纖維蛋白墊。B）在30分鐘、24小時和48小時的時間點，在0.25μg/mL的固定HRP濃度和不同H2O2濃度下的對照組和注入Amplex的絲素纖維蛋白墊。C）在24小時的時間點對用0.25μg/mL HRP處理過的墊子的顏色強度進行定量。D）在48小時的時間點對用0.25μg/mL HRP處理過的墊子的顏色強度進行定量。

圖7：使用糖尿病（Db/Db）傷口愈合的糖尿病小鼠模型，用注入Amplex的絲素蛋白墊進行H2O2顏色傳感。在這些體內研究中，使用了對照絲素蛋白墊、H2O2顏色傳感絲素蛋白墊（厚度約0.001mm）和H2O2顏色傳感絲素蛋白墊（厚度約為0.0043mm），即使用了注入Amplex的絲素蛋白墊。在糖尿病小鼠的皮膚上產生8毫米的皮膚傷口，適當地使用這些墊。觀察后發現，在24小時內，由于受到過氧化氫氧化分子和從傷口處滲出的過氧化物酶的影響，過氧化氫顏色傳感絲素蛋白墊的白色變為粉紅色，這表明24小時內濃度較高。