DOI:10.1021/acsbiomaterials.0c01311
基于細胞系的肝臟模型是進行肝臟相關研究的重要工具。但是，常規的肝細胞單層培養是目前應用最為廣泛的體外培養模型，它不具有細胞外基質（ECM），而細胞外基質有助于肝臟中肝細胞的三維（3D）排列。因此，單層組織培養物中肝細胞的代謝特性可能無法準確地反映肝臟中肝細胞的代謝特性。在此，研究者開發了一個模塊化平臺，用于在由靜電紡絲制備的纖維狀ECMs上進行3D肝細胞培養，該技術可以將聚合物溶液轉變為微纖維/納米纖維，已被廣泛用于生產3D細胞培養的支架。通過液相色譜-質譜（LC-MS）進行的代謝組學定量分析表明，與以單層培養的細胞相比，電紡絲素蛋白微纖維中生長的Huh7肝細胞顯示出降低的糖酵解和三羧酸（TCA）循環。進一步的機理研究表明，整聯蛋白與ECMs的作用有關。這是首次報道ECM支架是如何通過整聯蛋白影響肝細胞基本代謝的。
圖1.研究設計。（A）將由絲素蛋白靜電紡絲的超細纖維沉積在聚苯乙烯板上，然后將其激光切割成可固定在六孔板中的圓盤。（B）電紡纖維的SEM圖。纖維直徑為0.78±0.37μm（平均值±標準偏差）。（C）直方圖顯示了纖維直徑的分布。（D）不是直接在孔的底部培養細胞，而是將具有所需ECMs的圓形插入物（例如，纖維狀和扁平狀）用于細胞培養。
圖2.在纖維上和在平板上培養的Huh7細胞中的能量代謝物：糖酵解中的三個關鍵代謝物和三羧酸（TCA）循環中的五個關鍵代謝物顯著降低，表明能量代謝較低。由于糖酵解消耗減少，葡萄糖水平較高。N=15，誤差線=S.E.M.**p<0.01，*p<0.05，n.d.=無顯著差異。
圖3.（A）β-整聯蛋白的蛋白質印跡結果。在平板上培養的細胞具有更多的整聯蛋白。（B）定量蛋白質印跡結果（N=7，誤差=S.E.M）。（C）細胞內cAMP定量。已知整聯蛋白過表達可以降低cAMP水平。此處的數據（N=15，誤差=S.E.M.）證實，與纖維上的細胞相比，整聯蛋白在平板上的細胞中呈過度表達。（D，E）在纖維上與在平板上培養的細胞的形態。（F）纖維和平板上的細胞的細胞間隙（N=50）。（G）在纖維和平板上測得的孔面積（N=50，誤差=S.E.M）。*p<0.025，**p<0.01。
圖4.整聯蛋白抑制劑RGDS的功效。cAMP是整聯蛋白的下游標記，整聯蛋白的過度表達會降低細胞內的cAMP。平板上培養的細胞的cAMP顯著低于纖維上的細胞，這與本研究中的整聯蛋白數據一致。10μg/mLRGDS不能有效地抑制整聯蛋白，因為cAMP水平不變。50和100μg/mLRGDS均可增加cAMP，表明整聯蛋白具有抑制作用。但是，50μg/mL可使cAMP恢復至與纖維細胞相同的水平，因此被確認為最佳劑量。研究者還測試了陰性對照肽RGES，該肽不能阻斷整聯蛋白（cAMP沒有增加）。N=15，誤差線=S.E.M.**p<0.01，n.d.=無顯著差異。
圖5.使用整聯蛋白抑制劑（50μg/mLRGDS），所有檢測到的能量代謝物均恢復到與纖維細胞中相同的水平。作為對照，RGES（ctrl肽；50μg/mL）不能發揮作用。N=15，誤差線=S.E.M.，*p<0.05，**p<0.025，***p<0.01，n.d.=無顯著差異。G-6-P=葡萄糖-6-磷酸；F-1,6-P=果糖-1,6-磷酸；G-3-P=甘油醛-3-磷酸。
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