DOI:10.1016/j.msec.2020.111354
人類誘導多能干細胞（hiPSCs）衍生的心肌細胞（hiPSC-CMs）已被用于心臟再生和修復以及體外3D心臟組織模型的開發。現有的hiPSCs心肌分化方案采用了2D培養系統。然而，hiPSCs在3D培養體系中向心肌細胞分化的效率尚未得到廣泛的研究。本研究探索了在3D納米纖維支架上hiPSCs向功能性心肌細胞分化的效率。通過靜電紡絲法制備了同軸聚己內酯（PCL）-明膠纖維支架，并使用掃描電子顯微鏡（SEM）和傅立葉變換紅外（FTIR）光譜對其進行了表征。在納米纖維支架上培養hiPSCs并使其分化為功能性心肌細胞，與2D培養物進行比較。通過SEM、免疫熒光染色和基因表達分析來評估兩種系統的相對效率。2周后在2D培養物中觀察到分化的心肌細胞收縮，而4周后在3D培養物中觀察到該現象。SEM分析顯示，2D和3D培養中分化的細胞形態沒有顯著差異。但是，基因表達數據顯示3D培養物中心臟祖細胞基因（ISL-1，SIRPA）的表達顯著增加，而2D培養物中心肌細胞標志物（TNNT，MHC6）的表達顯著增加。相反，免疫熒光染色顯示NKX-2.5和α-肌節肌動蛋白的表達沒有實質性差異。此外，在3D纖維支架中觀察到原位分化的心肌細胞的均勻遷移和分布。總體而言，該研究表明，同軸PCL-明膠納米纖維支架可用作3D培養平臺，將hiPSCs有效分化為功能性心肌細胞。
圖1.靜電紡絲支架的表征。（A）SEM圖像顯示PCL-明膠同軸支架的隨機排列。（B）明膠、PCL和PCL-明膠同軸支架的SEM圖像。（C）明膠、PCL和同軸納米纖維支架的ATR-FTIR分析。
圖2.在2D和3D PCL-明膠同軸支架上培養的hiPSCs的比較評估。（A）培養72小時后hiPSC菌落的相襯圖像。比例尺：I：200μm；II：100μm。（B）在2D（I-II）和3D（III-IV）培養體系中培養的hiPSCs的SEM圖像。比例尺：I：50μm；II，IV：10μm；III：100μm。（C）熒光圖像顯示在2D（I-IV）和3D（V-VIII）的hiPSCs培養物中PSC標志物OCT4和SSEA4的表達。比例尺：50μm。
圖3.（A）在2D（I-III）和3D（IV-VI）培養體系中培養的hiPSCs的活性染色。代表性熒光圖像顯示了2D和3D培養體系中的活細胞（鈣黃綠素AM，綠色）和死細胞（BOBO-3碘化物，紅色）。比例尺：400μm。（B）在2D和3D培養體系中測定的乳酸脫氫酶（LDH）釋放。n=4，NS：*p>0.05。
圖4.在2D和3D培養體系中hiPSCs心肌分化的形態學和功能評估。（A）在D14（A）和D28（B）的2D培養和3D培養（C）中分化為心肌細胞的hiPSCs的相襯圖像。比例尺：500μm。（D）在2D培養（黑色）和3D培養體系（紅色）中，分化為功能性心肌細胞的hiPSCs的跳動頻率定量評估。（E）SEM圖像顯示在D14和D28的2D（I-II，V-VI）和3D（III-IV，VII-VIII）培養體系中由hiPSCs培養和分化為功能性心肌細胞的細胞表面形態。比例尺：I-IV：50μm；V＆VI：30μm；VII：5μm；VIII：10μm。
圖5.在D7的2D和3D培養體系中，hiPSCs心肌分化的免疫熒光分析。共聚焦圖像顯示了在2D（A-C）和3D（D-G）的hPSCs心肌分化過程中心臟祖細胞標志物NKX-2.5在D7的表達。比例尺：A-C：50μm；D-G：250μm；插圖（D-F）：20μm。黃色虛線表示同軸支架。
圖6.在D28的2D和3D培養體系中，hiPSCs心肌分化的免疫熒光分析。共聚焦圖像顯示了在2D（A-C）和3D（D-G）的hiPSCs分化過程中心肌細胞標志物肌節α-肌動蛋白（α-SA）的表達。比例尺：50μm。黃色虛線表示同軸支架。紅色和白色箭頭分別表示纖維和細胞。
圖7.在2D和3D培養的hiPSCs心肌分化過程中，心臟祖細胞（CP）和心肌細胞標志物的基因表達分析。條形圖顯示了在D0、D7和D28，2D和3D培養的心肌分化中CP相關基因SIRPA（A）和ISL1（B）以及心肌相關基因MHC6（C）和TNNT2（D）的表達相對于D0（未分化的hiPSCs）表達的倍數變化。數值表示為平均值±SEM，n=3；***p<0.001；D代表天。
