DOI: 10.1039/D0EN00268B
本研究旨在創建一種適用于細菌生物膜開發的固態納米結構支架，該生物膜使細菌能夠成功地抵抗惡劣的營養和環境條件，具有潛在的應用價值。作為一個模型系統，研究者將自立式靜電紡納米結構聚ε-己內酯基支架（EN-PCLS）與伯克霍爾德菌細胞結合在一起。制備支架結構的目的包括構建微珠和納米纖維，并在微尺度和納米尺度上模擬土壤的3D形態和空間結構，從而有利于開發合適的生物膜。由此產生的3D框架顯示出廣泛的孔隙率和孔隙互連性，并且蜂窩蠟細胞樣排列在土壤中復制出較大的孔。細菌首先在EN-PCLS上沉積一層調節膜，以促進粘附。研究者優先在納米纖維上觀察到細菌附著，這些細胞通常會沿著纖維定向，并且在攪拌下一直持續到孵育后期，如果珠子上沒有納米纖維，則珠子會呈無細菌狀態。隨著時間的流逝，這種相互作用在附屬物形成和釋放細胞外聚合物（EPS）的穩定性方面得到了改善。這導致與納米纖維之間更穩定的粘附，并具有增強的定植性，以及在EN-PCLS的蜂窩蠟細胞狀框架內部的納米纖維區域中形成扁平的細菌聚集體。此外，形成了3D微菌落和大菌落，其懸掛在蜂窩蠟細胞壁微珠之間的納米纖維上。這種微生物組織在孵育7天后演變成成熟的3D生物膜，細菌在其中形成緊密堆積的細胞層，其嵌入并由覆蓋整個EN-PCLS的EPS基質包裹。在生物膜形成的最后階段（11天），生物膜和支架框架都出現了部分降解，后者可能被用作碳源。因此，與傳統研究相比，觀察到的類似土壤的3D納米結構成功地使土壤細菌能夠在更自然的支架上形成生物膜。該策略有望創造出一種支架，作為成功的納米生物技術載體，用于農業（營養供應和植物病害的控制）和環境（污染土壤和廢水的生物修復）領域中。
圖1.不同水平的土壤顆粒聚集和參與的有機體（主要是微生物和根）形成土壤結構的示意圖。本研究中旨在模擬的水平由深紅色矩形突出顯示。
圖2.原始電紡納米結構（珠和纖維）PCL支架-1（EN-PCLS1）的光學圖像和SEM顯微照片。（A）EN-PCLS1的光學圖像，頂視圖。（B）EN-PCLS1的光學圖像，側視圖。（C）薄區的SEM顯微照片（放大65倍），顯示蜂窩蠟細胞狀排列，俯視圖。（D）厚區的SEM顯微照片，顯示出由蜂窩蠟細胞狀排列產生的薄片和尖峰，俯視圖。（E）厚區橫截面的SEM顯微照片，顯示與蜂窩蠟細胞壁向上延伸相對應的薄片和尖峰的珠子和纖維骨架的細節，相對的空腔顯示為通道或溝槽，其中纖維更明顯（黃色箭頭）；插圖為蜂窩蠟細胞狀排列壁（尖峰）上微珠的細節，通常看起來是融合的。比例尺：（A）=1 cm；（B）=1 mm；（C）=200 μm；（D）=500 μm；（E）=200 μm（插圖=100 μm）。
圖3.原始電紡納米結構（珠和纖維）PCL支架-2（EN-PCLS2）的光學圖像和SEM顯微照片。（A，B）膜的蜂窩蠟細胞狀排列，光學顯微鏡和SEM。（C）SEM顯微照片顯示通過靜電紡絲微珠和纖維沉積衍生出的蜂窩蠟細胞狀排列的俯視圖。（D）微珠和纖維框架橫截面的光學顯微鏡圖像（紅色和淺藍色箭頭）。（E）SEM顯微照片顯示靜電紡絲后蜂窩蠟細胞狀排列的壁，這些壁通常由微珠組成（綠色箭頭）。（F）SEM顯微照片詳細顯示了構成電紡織物的微珠（橙色箭頭）和納米纖維（淺藍色箭頭）之間的尺寸比例。（G）SEM顯微照片詳細顯示了組成電紡織物的納米纖維；橙色箭頭=單納米纖維；白色箭頭=分裂的納米纖維。比例尺：（A）=2.4 mm；（B）=2 mm；（C）=100 μm；（D）=40 μm；（E）=200 μm；（F）=10 μm；（G）=1 μm。
圖4.電紡納米結構PCL支架（EN-PCLSs）的表征：A）沉積后原始EN-PCLS2中珠子直徑的分布。（B）沉積后原始EN-PCLS2中纖維直徑的分布。（C）在沉積和與細菌孵育3小時后，原始EN-PCLS2的蜂窩蠟細胞狀排列中的腔直徑分布。D）EN-PCLSs的接觸角（EN-PCLS1和EN-PCLS2的液滴量分別為8μl和7μl）。在納米骨架的SEM顯微照片中測量EN-PCLS2不同結構（珠、纖維和空腔）的尺寸（n=220（A）；n=145（B）；n=135（C））。結構的平均值和中值顯示在相關圖中。
圖5.在B.terricola細胞懸浮液中孵育3小時后的EN-PCLSs的SEM顯微照片：（A）當細菌將其沉積在腔內但靠近壁的納米纖維網絡上時，條件層（CF）形成膜。蜂窩蠟細胞狀結構（淺藍色箭頭）；橙色箭頭=被CF覆蓋的微珠。（B）CF在蜂窩蠟細胞狀結構的納米纖維腔中大量沉積（淺藍色箭頭）；黃色箭頭=從涂層突出的微珠聚集體。比例尺：（A）=10 μm；（B）=100 μm。
圖6.SEM顯微照片表明在培養過程中，B.terricola細胞普遍附著在EN-PCLSs納米纖維上。（A）細菌在孵育5小時后開始粘附在接近蜂窩蠟細胞狀排列腔壁的納米框架上；淡藍色箭頭=經5小時孵育和細胞使其沉積后，條件層（CF）在蜂窩蠟細胞樣結構內的納米纖維網絡上形成膜；黃色和粉紅色箭頭=蜂窩蠟細胞狀結構壁中的微珠和包埋在納米纖維網絡中的單個微珠的聚集體，表明沒有細菌附著在其上；橙色和紅色箭頭=B.terricola細胞分別附著在空腔和微珠上的納米纖維上；黃色圓圈=外膜囊泡（OMV）分布在納米纖維上并成簇聚集；（B）在培養的早期階段（5小時），B.terricola細胞和納米纖維的相互作用；粉色箭頭=i）細菌細胞與納米纖維之間非常緊密的相互作用，指出了這兩種成分之間的大小差異很大；ii）聚合物基質包圍細菌細胞并包裹CF涂覆的納米纖維，iii）OMVs附著在細菌表面和接口處；橙色箭頭=CF沉積后較大尺寸的納米纖維。（C）在培養的早期階段（5小時），B.terricola細胞和微珠的相互作用；紅色箭頭=細菌細胞僅在存在納米纖維的地方粘附到微珠上；粉色箭頭=細菌細胞懸掛在納米纖維上；黃色箭頭=CF涂覆微珠。（D）孵育48小時后，B.terricola細胞與微珠的相互作用；淡藍色箭頭=細菌附著在微珠上，只要后者被納米纖維覆蓋；橙色箭頭=沒有納米纖維沉積的無細菌微珠。比例尺：（A）=10 μm；（B）=1 μm；（C）和（D）=5 μm。
圖7.B.terricola細胞與EN-PCLSs的穩定附著：（A）SEM顯微照片表明孵育28小時后，B.terricola細胞開始形成附著物，這些附著物在徑向分布后錨定在納米纖維網絡上（橙色箭頭）和彼此結合（淺藍色箭頭）；綠色箭頭=B.terricola細胞呈球形（其他細胞呈卵形形態）。（B）粘附于微珠的B.terricola細胞的TEM顯微照片：綠色箭頭=細菌附屬物，使細胞附著于微珠；淺藍色箭頭=CF沉積在微珠上；粉色箭頭=缺少CF的微生物表面；紅色箭頭=囊泡將微生物附屬物連接到CF涂層的微珠表面（實心箭頭），或無涂層的微珠表面（虛線箭頭）；插圖=電子致密囊泡和明亮核囊泡的橫截面（分別是虛線的紅色和藍色環）。（C）孵育48小時后，B.terricola細胞的SEM顯微照片顯示出球形（綠色箭頭）和卵形形態。（D）孵育28小時后，B.terricola細胞的TEM顯微照片，在某些情況下與納米纖維直接相互作用，此處通常表現為橫向和縱向截面（橙色箭頭）。比例尺：（A）和（B）=1 μm；（C）和（D）=2 μm。
圖8.孵育5 h至28 h后，B.terricola細胞定植EN-PCLSs的SEM顯微照片：（A）孵育5 h后，懸掛在蜂窩狀結構中懸浮納米纖維上的桿狀細胞的微菌落形成。（B）在20小時的溫育期后，細菌微菌落在EN-PCLSs的微小納米纖維上顯示出優先的生長和擴大；橙色箭頭=穿過菌落的孔。（C）孵育28小時后觀察到B.terricola細胞對EN-PCLSs的廣泛定殖：顯示的區域靠近蜂窩蠟細胞狀排列的腔壁；黃色箭頭=空腔納米纖維網絡的定植；淡藍色箭頭=在存在納米纖維網絡的情況下，微珠之間的空間定植。（D）孵育28小時后，B.terricola細胞的3D微菌落普遍位于微珠之間的空間（粉紅色箭頭）；橙色箭頭=穿過菌落的孔。比例尺：（A）=2；（B）和（C）=5 μm；（D）=10 μm。
圖9.培養48小時后，B.terricola細胞定植EN-PCLSs的SEM和TEM顯微照片：（A）B.terricola細胞3D大菌落的SEM顯微照片，當存在納米纖維網絡時，其優先位于微珠聚集體之間的廣闊空間中；淡藍色箭頭=納米纖維網絡作為支撐，以形成大菌落；橙色箭頭=穿過菌落的孔。（B）SEM顯微照片顯示當這種基質逐漸封裝和包埋細菌細胞時，EPS釋放及其參與細菌間以及與EN-PCLSs之間穩定相互作用的形成。（C）TEM顯微照片顯示被EPS包圍的細菌細胞，以細胞周圍的黑色暈圈出現。比例尺：（A）=10；（B）=1 μm；（C）=2 μm。
圖10.在納米結構PCL織物表面形成生物膜的過程中，通過將INT還原為甲瓚，可以測量B.terricola細胞的存活率和代謝活性。（A）和（B）EN-PCLSs的圖片顯示紅色的變化和分布，這是由于INT顯著還原為甲瓚所致，并且與定植納米結構織物中細菌的程度變化和細菌擴散有關：（A）首先在膜的邊界發生EN-PCLSs的定植；（B）向內進行定植，直到遍布整個納米框架。（C）基于從EN-PCLS中提取的甲瓚在495nm處的吸光度，然后標準化為EN-PCLSs的大小（即1 mm2），在孵育期（11d）內細菌種群生長的動態；插圖顯示在不同孵育期采樣的EN-PCLSs上INT-甲瓚的程度，并且與墊子上細菌種群的生長和代謝活性有關。
圖11.孵育7天后在EN-PCLS上形成的B.terricola生物膜的SEM顯微照片（BEN-PCLSs）。（A）在EPS基質中嵌入一層致密的細菌，總體上形成覆蓋EN-PCLSs的均勻涂層，從而產生年輕的生物膜（BEN-PCLSs）；綠色箭頭=沒有沉積納米纖維的微珠仍然呈無細菌狀態；黃色箭頭=穿過菌落的孔；淡藍色箭頭=表面上帶有納米纖維的微珠可容納細菌，具體取決于沉積的納米纖維的數量。（B）BEN-PCLSs的概述表明，在微生物群落進化的這一階段，由于細菌含量高以及EPS涂料的廣泛存在，幾乎無法識別出納米結構織物的原始蜂窩蠟細胞樣結構（圖11b，黃色圓圈）。（C）在BEN-PCLSs上形成的成熟生物膜的概述，其中EPS形成了一層厚的基質，既包埋細菌細胞又包埋了納米纖維骨架，最終看上去像毯子一樣覆蓋在膜上（粉紅色箭頭）；綠色箭頭=從EPS基質突出的細菌菌落；黃色箭頭=穿過菌落的孔。比例尺：（A）=10；（B）=200 μm；（C）=5 μm。
圖12.SEM顯微照片顯示，孵育11天后，B.terricola細胞在EN-PCLSs上產生的生物膜降解情況。（A）覆蓋在BEN-PCLSs上的EPS涂層的部分降解，以廣泛的裂口突出（綠色箭頭）顯示；（B）頂部EPS涂層下方細菌菌落化的納米框架的降解，顯示出微珠（粉紅色箭頭）和支撐細菌菌落的纖維網絡（橙色箭頭）（淺藍色箭頭）均破裂。（C）覆蓋BEN-PCLSs的EPS涂層的多層組織，出現撕裂現象（黃色箭頭）。（D）從降解引起的裂紋可見EPS涂層的厚度（淺藍色箭頭）。比例尺：（A）=20；（B）=10 μm；（C）=1 μm；（D）=20 μm。
圖13.比較了本研究中確定的目標，即在微尺度和納米尺度水平上模擬3D土壤結構的3D納米結構織物的創建，以便更“自然地”被細菌定植，直到形成適當的成熟生物膜，以及相關結果。（A）由各種固體顆粒（淤泥、粘土和氧化物）和有機物（微生物碎片和腐殖質）的聚集體組成的土壤概念模型示意圖，以及在微尺度上天然土壤聚集體的3D圖像（B）。草圖中的組件已根據相對平均尺寸進行了復制。（B）中的黃色矩形指出了典型的土壤小顆粒。（C）此處制作的3D電紡納米結構框架（EN-PCLS）的草圖，由小球和纖維組成，分別用于再現真實土壤中的固體顆粒和纖維狀有機物，以及生成的真實EN-PCLS的圖像（D）。（D）中的黃色矩形突出顯示了與（B）中尺寸相似的微珠和纖維狀有機材料聚集體的存在。（E）（A）中細菌定植土壤聚集體的草圖，以及生物膜形成細菌（F）定植的天然土壤微聚集體的3D圖像。（H）在被細菌定植時制作的EN-PCLSs的示意圖，以及在成熟生物膜形成后被細菌定植的EN-PCLS的圖像（G）。（F）圖片由東北大學的劉易斯實驗室提供。
