DOI: 10.1002/bit.27465
本研究開發了一種微創、可靠且廉價的技術，能夠實時監測生物材料支架上的細胞反應，改善基于支架的組織工程策略的最終結果。為了建立原位生物活性與細胞命運之間的相關性，研究者開發了一套完整的工作流程，用于在電紡網格上對純小膠質細胞培養物中時空變化的胞質鈣振蕩進行實時體積成像。在隨機取向電紡纖維上培養的HMC3細胞用熒光染料染色，并用激光掃描共聚焦顯微鏡成像。在不影響空間和時間分辨率的情況下，共振掃描在獲得細胞內鈣水平的時程方面提供了高分辨率。3D重建和深度編碼使細胞位置和細胞內鈣水平的可視化隨樣品厚度發生變化。重要的是，根據生化線索和變化的基質結構，即隨機取向和定向纖維，對細胞形態的變化和響應中的原位鈣峰值進行定量。從峰值數據生成的柵格圖顯示了特定于培養條件的鈣簽名。將來，該方法可用于闡明鈣簽名與細胞表型/激活之間的相關性，并促進生物醫學應用支架的合理設計。
圖1：該方案的工作流程：聚合物基質制備，在基質上培養的細胞的共聚焦成像，成像方式，共振掃描和3D圖像重建。
圖2：（a）隨機取向PLGA纖維的SEM圖像（比例尺：10μm）和（b）HMC3細胞在隨機取向PLGA纖維上的明場顯微鏡圖像（比例尺：100μm）。
圖3：2D DIC尺寸縮小后的壓縮z-stack圖像，在未經和經ATP處理的情況下，對隨機取向PLGA纖維上培養的HMC3細胞進行Fluo-4染色的熒光和共聚焦圖像。比例尺代表100 μm。
圖4：從Fluo-4染色HMC-3細胞獲得的2D和壓縮z-stack（3D合并）強度分布的比較：（a）2D單焦平面的共焦圖像，（b）通過壓縮32個z-stack獲得的共焦圖像，（c）從單個平面獲得的Fluo-4強度的延時，（d）從壓縮的z-stack圖像中獲取的Fluo-4強度的延時。圖（a）和（b）中的比例尺為100 μm，插圖顯示了更高放大倍數的細胞。
圖5：隨機取向纖維上的小膠質細胞：（a）纖維網絡內細胞的3D深度編碼圖像，（b）僅細胞的3D深度編碼圖像（未顯示纖維），（c）纖維網絡中的Fluo-4染色細胞的熒光圖像和（d）僅Fluo-4染色細胞的熒光圖像（未顯示纖維），（e）在不同深度存在的三個代表性細胞的z-stack圖像和（f）熒光強度熱圖。比例尺代表100 μm。（c）圖中的箭頭指向細胞。
圖6：延時熒光強度圖譜：隨機取向PLGA纖維上培養的單個細胞（即三個代表性Fluo-4染色的HMC3細胞）中的鈣振蕩：（a）未經和（b）經ATP處理。所有圖的比例尺代表20 μm。
圖7：從圖像中提取鈣尖峰數據：五個代表性Fluo-4染色HMC3細胞的壓縮z-stack圖像：（a）未經和（c）經ATP處理。（b）未經和（d）經ATP處理的五個細胞中400 s內相應的鈣離子峰值時間曲線。
圖8：在ATP處理之前和之后，在隨機取向的PLGA纖維上生長的小膠質細胞中鈣尖峰的比較：（a）最大振幅，（b）尖峰峰數/400 s。在隨機取向PLGA纖維上培養的Fluo-4染色的HMC3細胞中鈣峰值位置的光柵圖：（c）不含ATP和（e）含ATP。圖（d）和（f）中顯示了相應的Pearson相關矩陣。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
圖9.用ATP處理，在定向PLGA纖維上培養的Fluo-4染色的HMC3細胞：（a）定向PLGA纖維的SEM圖像（比例尺：10μm），（b）帶有深度編碼的3D重建圖像（比例尺：100 μm），（c）壓縮的z-stack圖像，描繪了五個細胞內的鈣通量（比例尺：100 μm），（d）相應的柵格圖顯示五個細胞在400 s內的鈣峰值位置。
圖10：隨機取向和定向電紡纖維的纖維結構和細胞形狀/鈣峰值響應的比較：（a）纖維直徑，（b）纖維角度標準偏差，（c）胞長軸長度，（d）胞長寬比，（e）鈣振蕩的最大幅度，（f）尖峰峰數/400 s。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
