DOI: 10.1126/sciadv.aax5083
致密基質阻礙了間質細胞遷移和隨后的修復。假設核剛度是遷移的一個限制因素，且認為可以通過暫時降低核剛度加快修復速度。為了測試這一點，研究者通過應用組蛋白脫乙酰基酶抑制劑曲古他汀A（TSA）或敲除絲狀核蛋白Lamin A/C，研究了成年半月板細胞在核軟化前后通過致密纖維網絡和成年組織的間質遷移能力。結果表明，核的瞬時軟化可改善通過微孔膜、電紡纖維基質和組織切片的遷移，并且處理后核特性和細胞功能得以恢復。研究者還表明，TSA的生物材料遞送促進了內源性細胞對支架的體內細胞化作用。通過解決由核僵硬引起的修復的固有局限性，這項工作開發了一種促進受損致密結締組織修復的新策略。
圖1.TSA處理可增加半月板細胞核的可變形性和通過微孔膜的遷移。（A）對照組中組蛋白-H2B[頂部；（-）TSA]或經TSA處理的MFC核[底部；（+）TSA]的代表性常規熒光和STORM成像。（B）對應的基于Voronoi的圖像分割，可對組蛋白-H2B納米域進行可視化和量化。（C和D）用TSA處理每個簇和簇區的H2B定位數的量化。框、線和點分別對應于十分位數范圍（第10至90百分位數）、中位數和平均值，Mann-Whitney U檢驗，n≥來自5個細胞的10584個簇。在每個Voronoi圖像旁邊，顯示了正方形內部區域的更高放大倍率圖像。（E）TSA處理3小時可減少4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色核中的染色質凝聚（比例尺，5μm），并減少可見邊緣的數量（左）。用TSA處理染色質凝聚參數（CCP）的定量[右；*P＜0.05，相對于（-）TSA，n≈20]。（F）示意圖顯示了用于評估細胞變形時核變形能力和核長寬比（NAR=b/a）變化的實驗設計。（G）在15％拉伸（左；比例尺，20μm）前后支架上具有代表性的DAPI染色核，以及3％和15％拉伸的NAR（n=32至58個細胞，相對于（-）TSA，*P＜0.05；相對于3％，+P＜0.05）。（H）2D傷口閉合試驗顯示，在存在或不存在TSA的情況下，間隙填充無差異。左：比例尺，200μm；右：P＞0.05，n=6）。（I）帶有和不帶有TSA預處理的Boyden室趨化性測定的示意圖（左）和通過3、5和8μm直徑孔遷移的細胞信號強度[右；n=每組5個樣本，相對于（-）TSA，*P＜0.05；相對于3μm，+P＜0.05，平均值±SD]。
圖2.核軟化增強了半月板細胞通過致密纖維網絡的遷移。（A）“PDMS[聚二甲基硅氧烷]/納米纖維遷移室”的示意圖（頂部）和俯視圖（底部）。（B）示意圖顯示半月板細胞（綠色）播種到熒光標記的納米纖維上，該纖維嵌入在含有BM的頂部儲庫和含有BM且添加PDGF（100 ng/ml）作為化學引誘劑的底部儲庫之間。（C）微型設備中可溶性因子梯度的可視化呈現，臺盼藍在上腔室中的緩慢積累隨時間的變化。（D）顯示半月板細胞（MFC）的分離并接種到納米纖維基底上的實驗示意圖（從成年牛半月板分離）。接種后第一天，將TSA或PDGF分別添加到頂部儲層或底部儲層中，并將細胞再培養2天。在第3天，通過共聚焦顯微鏡對支架成像，以測定進入支架的細胞滲透度。（E）在有或沒有TSA處理的情況下，通過AL或非AL（NAL）納米纖維網絡（AL或NAL；紅色）的細胞（綠色）遷移的3D共聚焦重建。比例尺，30μm。（F）納米纖維基質（紅色）中的細胞（綠色）的橫截面圖。比例尺，30μm。量化浸潤細胞的百分比（G）[n=5至8張圖像，相對于（-）TSA，*P＜0.05；相對于AL，+P＜0.05，平均值±SD]和細胞浸潤深度（H）[n=33個細胞，相對于（-）TSA，*P＜0.05；相對于AL，+P＜0.05，平均值±SEM，標準化為（-）TSA/AL組]。浸潤細胞百分比的定量分析（I）[n=5張圖像，相對于（-）TSA，*P＜0.05；相對于0％聚環氧乙烷（PEO），?P＜0.05；相對于25％PEO，aP＜0.05，平均值±SD]和細胞浸潤深度（J）[n=33個細胞，相對于（-）TSA，*P＜0.05；相對于0％PEO，?P＜0.05；相對于25％PEO，aP＜0.05，平均值±SD，標準化為對照PCL/0％PEO組]與PEO含量的函數關系。所有實驗均重復三次。
圖3.通過致密纖維網絡進行細胞遷移的計算模型。（A）示意圖顯示了一個狹窄通道上方的核（藍色），代表了致密纖維網絡（橙色）中的小孔。幾何參數是核的半徑（rn）和通道的半寬度（rg）。剛度參數是核的模量（En）和纖維網絡（EECM）。為簡單起見，將核視為球體。（B）核進入并通過致密纖維網絡通道的模擬。核遇到的歸一化阻力與核歸一化位移的函數關系。最大歸一化阻力定義為臨界力。（C）臨界力與歸一化ECM模量（相對于En）和歸一化通道尺寸（相對于rn）的函數關系。當ECM變硬或通道變小時，臨界力會更大。（D）臨界力隨著PEO含量的增加而降低。TSA處理還降低了臨界力，特別是對于致密網絡（PEO含量低）。（E）進入通道后的歸一化NAR隨著ECM變硬或核變軟而增加（兩者都會導致更大的歸一化ECM模量EECM/En）。
圖4.停止TSA后染色質凝聚、核變形能力和組蛋白乙酰化水平的變化。（A）顯示實驗裝置的示意圖；在有/無TSA處理的情況下，將成年MFC接種在BM中的AL納米纖維支架上1天，然后在沒有TSA的新鮮BM中再培養5天。（B）代表性DAPI染色細胞核（上）和相應的可見邊緣檢測（下）（比例尺，3μm）和（C）（A）中所示時間點的染色質凝聚參數（紅線；第0天的BM對照），n≈20個核，相對于對照組，*P＜0.05，平均值±SEM。（D）施加拉伸強度為3％和15％的NAR（歸一化為0％的NAR，n=65?80個細胞，相對于3％，*P＜0.05；相對于對照組，+P＜0.05；相對于第0天，?P＜0.05；相對于第1天，aP＜0.05，平均值±SEM）。（E）細胞核（藍色）中Ac-H3K9（綠色）的免疫染色和免疫染色平均強度的定量分析（F）（n≈28個細胞，相對于對照組，*P＜0.05；相對于day 0，+P＜0.05，平均值±SEM]。a.u.，任意單位，所有實驗均一式三份進行。
圖5.核軟化促進工程化構建體中的細胞入侵。（A）實驗示意圖顯示MFC播種在PCL/25％PEO納米纖維支架上，該支架在化學限定培養基中培養，每周進行一次TSA處理。4周后，評估了有/無TSA處理的ECM生成和細胞浸潤。在第4周，對膠原蛋白（B）和細胞核（C）染色的MFC負載納米纖維構建體的代表性橫截面圖像。比例尺，100μm。（D）量化有/無TSA處理的MFC滲透（n=來自3個獨立樣品的3張圖像，相對于（-）TSA，*P＜0.05，平均值±SEM）。實驗一式兩份進行。PSR，天狼星紅。
圖6.核軟化增強了原發組織間質性MFC的遷移。（A）示意圖顯示了用于入侵檢測的重要組織外植體和失活組織切片的處理過程。通過共聚焦顯微鏡評估細胞從重要組織遷移并浸潤到失活的組織切片。（B）在有/沒有TSA處理的情況下，穿過失活組織切片（藍色）的細胞（綠色）遷移3D重建（比例尺，200μm）和（C）橫截面圖（比例尺，50μm）。（D）量化浸潤細胞的百分比[n=6張圖像，相對于（-）TSA，*P＜0.05，平均值±SD]和細胞浸潤深度[n≈40個細胞，相對于（-）TSA，*P＜0.05，平均值±SEM]。實驗一式三份進行。（E）靜電紡絲原理圖，顯示了兩個獨立的纖維束同時收集到一個共同的旋轉心軸上。離散的纖維群由含TSA和PCL的PEO組成。（F）顯示半月板細胞接種到納米纖維基底上的實驗示意圖。接種后一天，將復合PCL/PEO TSA釋放（PPT）支架添加到微流體腔室中，并將細胞再培養2天，然后進行共聚焦成像。（G）在有/無支架介導TSA遞送的情況下，通過AL納米纖維網絡進行細胞（綠色）遷移的3D共聚焦重建（比例尺，100μm）并量化浸潤細胞的百分比[n=5張圖像，與（-）TSA相比，*P＜0.05；與（+）TSA相比，+P＜0.05；以及與100 ng相比，#P＜0.05，平均值±SD。生物分子的負載量（每個支架的質量）基于靜電紡絲參數和支架質量]。（H）在大鼠模型中修復構建體組件和皮下評估的示意圖。（I）在有/無TSA遞送的情況下，皮下植入1周后修復構建體中心的DAPI染色核（藍色）圖像。虛線表示組織-支架界面。比例尺，300μm。（J）在有/無生物材料介導TSA釋放的情況下，支架每個區域內的細胞數量（n=來自三只不同動物的3個樣品，與PCL/PEO相比，*P＜0.05）。
