DOI:10.1016/j.cej.2020.125939
外泌體作為一種先進的載體，由于其優異的生物相容性、高效的細胞攝取和簡便的靶向修飾，在基因和藥物遞送中得到了廣泛的應用。除了生物活性分子的常規可控遞送外，一些其他外泌體的作用還需要進一步探索。在此，研究者報告了一種構建特異性基因激活的工程外泌體，它不僅可以有效調節血管內皮生長因子165（VEGF165）的基因釋放，而且在增強血管化骨再生的治療中也發揮著關鍵作用。該研究表明，通過基于外泌體的載體，VEGF165質粒基因的轉染效率大大提高。單獨的外泌體和工程外泌體在體外均表現出一定的間充質干細胞（MSC）成骨細胞分化。更重要的是，基于對大鼠體內臨界尺寸顱骨缺損模型的評估，內化VEGF165基因并結合電紡納米纖維膜的工程外泌體在成骨和血管生成中起著雙重作用。因此，當前的工作創造了一種基于雙功能工程外泌體的生物材料，可指導體外干細胞分化并促進體內血管化骨再生，從而將外泌體的應用范圍從簡單的生物分子載體擴展到外泌體增強療法。
圖1.本研究的總體思路。（A）通過電穿孔將VEGF165質粒基因封裝到ATDC5衍生的外泌體中。（B）通過細胞攝取將基因激活的外泌體內化為間充質干細胞（MSC）。（C）通過攝取工程化外泌體成功誘導了MSC的成骨分化。（D）VEGF165的蛋白表達完成并被遞送以調節細胞命運。（E）制備電紡納米纖維膜并用聚多巴胺對其進行改性。（F）將基因激活的工程外泌體連接到聚多巴胺修飾的納米纖維膜中，以構建工程外泌體激活基質。（G）通過在大鼠臨界尺寸顱蓋缺損的表面覆蓋工程外泌體激活基質來介導血管化成骨作用。（H）在愈合過程中，新生血管的密度從早期到晚期逐漸降低。
圖2.ATDC5衍生外泌體的表征。（A）通過TEM觀察外泌體的形態。（B）外泌體特異性蛋白的蛋白質印跡結果。（C）通過NTA測量外泌體的粒度分布和數量濃度：外泌體的平均粒徑為111.4 nm，半峰全寬（FWHM）為74.1 nm，原始濃度為5.2×1010粒/mL。（D）由NTA捕獲的外泌體的動態屏幕截圖。
圖3.ATDC5衍生的外泌體作為天然質粒載體的功能。（A）通過大鼠骨髓來源的間充質干細胞（BMSCs）評估負載hVEGF165質粒外泌體的攝取情況。質粒被釋放到細胞質中，并通過轉錄和翻譯表達并分泌hVEGF165蛋白。（B）將DiI標記的外泌體（橙色斑點）與BMSC孵育并內化3、24和48 h。BMSC的細胞核用DAPI（藍色）染色。（C）通過cck-8測量BMSC的生長曲線。（D，E）通過Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳測量質粒的負載效率。（F，G，H）通過mRNA轉錄水平、上清液分泌蛋白水平和細胞內蛋白表達水平體外驗證質粒轉染效率。
圖4.ATDC5衍生的外泌體促進了MC3T3-E1的成骨分化。（A，B）MC3T3-E1中成骨基因Runx2、OCN、OPN和hVEGF165的表達證實外泌體和工程外泌體均可誘導MC3T3-E1的成骨分化。（C）ALP染色顯示分化趨勢隨著培養時間的增加而明顯增強。（D）茜素紅染色清楚地表明，與空白對照相比，外泌體和工程外泌體均顯示陽性染色。
圖5.電紡納米纖維薄膜的理化特性和生物相容性評估。（A）電紡納米纖維材料在聚多巴胺（pDA）改性之前和之后的照片圖像。（B）水接觸角的結果表明，未經和經過pDA改性的電紡納米纖維膜沒有明顯的區別。（C）FTIR的結果證實了這一點。（D）掃描電子顯微鏡（SEM）結果。（E）通過cck-8測量的生長曲線以研究材料的細胞毒性。通過（F）共聚焦顯微鏡和（G）SEM觀察細胞粘附情況。（H）通過SEM觀察材料對外泌體的粘附能力。
圖6.動物實驗步驟和Micro-CT結果。（A）建立大鼠臨界尺寸顱骨缺損模型，并在缺損處放置實驗材料。（B）Micro-CT的重建。（C）Micro-CT分析。
圖7.血管生成和成骨的組織學結果。（A）在第6周通過H＆E和Masson染色觀察骨再生情況。（B）在第4周通過免疫組織化學評估成骨和血管生成。
