DOI:10.1038/s41598-020-66281-6
骨缺損是肌肉骨骼手術中的常見問題。自體骨移植的替代物受到移植材料可用性的限制。無菌的松質骨雖然具有骨傳導性，但其骨誘導能力有限。納米纖維支架由于其具有模擬細胞外基質的能力，目前被用于多種用途。此外，它們允許修飾以提供功能特性。在此之前，已證明了靜電紡納米纖維可用于骨骼組織再生。利用I型膠原納米纖維骨誘導能力的同時，研究者發現減小的支架孔徑限制了細胞遷移，從而阻礙了支架的定植。本研究的目的是將間充質干細胞結合到納米纖維支架的靜電紡絲過程中，以生產用于骨替代物的細胞接種納米纖維支架。構建具有獨立可控的紡絲和噴涂裝置以用于同時進行靜電紡絲和噴涂，并對紡絲工藝進行廣泛優化后，體內外評估了所得支架的性能。通過同時靜電紡絲和噴涂將從大鼠股骨中分離出的干細胞融合到PLLA（聚乳酸）和PLLA-I型膠原納米纖維支架（PLLA Col I共混物）中。體外評估其代謝活性、增殖和成骨細胞分化。為了進行體內評估，將支架植入大鼠頭骨的臨界尺寸缺損處。4周后，處死動物并使用CT掃描、組織學、免疫組化和熒光評估分析骨愈合情況。通過重復紡絲和噴涂條件將間充質干細胞成功整合到支架中，這些條件包括聚合物溶劑、紡絲距離、液體對電極的使用、電極電壓和紡絲持續時間。研究表明，體內形成了骨組織。使用PLLA支架，發現無細胞和細胞接種支架的結果相當，而與無細胞的PLLA-膠原支架相比，細胞接種的PLLA-膠原支架顯示出明顯更好的骨形成。該研究結果為細胞接種納米纖維支架在大骨缺損中的應用提供了支持。
圖1.開發植入細胞支架的步驟和紡絲裝置。優化過程的流程圖（A）和紡絲設備的示意圖（B）1.電壓源在0-30 kV之間變化（2個獨立）；2.兩個液壓泵的電機控制；3＆4.帶步進電機和螺桿的液壓泵；5＆6.2個獨立的紡絲頭，每個紡絲頭由4個注射器組成；7.旋轉對電極；8.加濕裝置及供氣；9.抽氣；10.調溫燈。
圖2.通過多噴嘴靜電紡絲獲得的PLLA納米纖維支架的物理表征。多噴嘴靜電紡絲（A）和對電極類型（B）對支架質量沉積的影響。通過干（C）或濕（D）對電極制備的納米纖維。多噴嘴靜電紡絲和對電極類型對計算孔徑（E）的影響。機械穩定性取決于對電極（G，H）和支架的水容量（F）。
圖3.在細胞接種的納米纖維支架構建過程中影響細胞存活的參數。將DMEM中的細胞懸浮液通過1至4個設備進行電噴涂，其中含100000至400000個細胞，并用2個設備構建支架。流速、電壓、溶劑、支架聚合物的紡絲/噴涂距離和時間以及對電極均按文中所述進行了更改。支架制備后直接通過FDA/EtBr（B）染色，每個條件下由6至27個探針進行分析，或者在培養24小時后（A，C，E，F，G），通過MTT分析至少3個支架。通過1至3個設備噴涂不同的彩色墨水，可以看到多個噴涂設備之間的噴射相互作用（D）。由于紡錘體的間距不合適，納米纖維沉積失敗（H）。數據代表平均值和標準偏差。
圖4.使用靜電紡絲和電噴涂相結合的工藝，摻入PLLA納米纖維支架的細胞在體外（A-F）和體內（G-L）的生長和存活。將約200000-400000個細胞摻入PLLA納米纖維支架中，在DMEM培養基中于生長（3個支架）和骨誘導（3個支架）條件下培養22天，使用MTT分析（一式三份）評估其代謝活性。使用5個伊紅染色的感興趣區域分析細胞密度/分布，其中每個區域和時間點（B生長；C骨誘導條件）由3個石蠟包埋的支架組成。使用熒光TUNEL法在每個時間點和條件的3個石蠟包埋支架的至少3個組織切片中測定凋亡（D-F）。對從16個缺損處獲得的48個切片（細胞接種組）或從10個缺損處獲得的30個切片（對照組）進行體內分析。通過HE染色的石蠟切片（H，I）中的總細胞數（G）測定支架內的細胞密度。注釋無細胞區域。通過熒光TUNEL法測定石蠟包埋的組織切片中的細胞凋亡，并進行總細胞計數和陽性細胞計數（J-L）。數據代表相應AOI的平均值和標準偏差。
圖5.細胞接種PLLA納米纖維支架體外（A-C）和體內（D-G）的骨誘導能力。在生長和骨誘導條件下，在DMEM培養基中培養22天的含有400000個細胞的PLLA納米纖維支架（每個時間點和條件下3個支架）。使用石蠟包埋組織切片（A，B生長；C骨誘導條件）的Von Kossa染色，在5個感興趣區域測定體外骨誘導能力。通過對無細胞（E）或含細胞（F）支架的Masson Goldner染色（D）以及OC的免疫組織化學染色（G），測定了16個缺損（細胞接種組）的48個感興趣區域或10個缺損（對照組）的30個感興趣區域中的體內骨形成。數據代表相應AOI的平均值和標準偏差。
圖6.使用靜電紡絲和電噴涂相結合，摻入PLLA-膠原蛋白混合納米纖維支架的細胞在體外（A-F）和體內（G-L）的生長和存活。將約70萬至200萬個細胞摻入PLLA納米纖維支架中，并在DMEM培養基中于生長（3個支架）和骨誘導性（3個支架）條件下培養22天，并使用MTT法分析代謝活性（a）。使用5個伊紅染色的感興趣區域分析細胞密度/分布，其中每個區域和時間點（B生長；C骨誘導條件）由3個石蠟包埋的支架組成。使用熒光TUNEL法測定在每個時間點和條件的3個石蠟包埋支架的至少3個組織切片中的細胞凋亡（D-F）。對從16個缺損獲得的48個切片（細胞接種組）或從10個缺損獲得的30個切片（對照組）進行體內分析。通過HE染色的石蠟切片（H，I）中的總細胞數（G）測定支架內的細胞密度，使用熒光TUNEL法測定石蠟包埋的組織切片中的細胞凋亡，并進行總細胞計數和陽性細胞計數（J-L）。數據代表相應AOI的平均值和標準偏差。
圖7.細胞接種PLLA-膠原蛋白混合納米纖維支架的體外（A-C）和體內（D-G）骨誘導能力。在生長和骨誘導條件下，在DMEM培養基中培養含400000個細胞的PLLA納米纖維支架長達22天（每個時間點和條件下3個支架）。使用石蠟包埋的組織切片（A，B生長；C骨誘導條件）的Von Kossa染色，在5個感興趣的區域測定體外骨誘導能力。通過對無細胞（E）或含細胞（F）支架的Masson Goldner染色（D）以及OC的免疫組織化學染色（G），測定了16個缺損（細胞接種組）的48個感興趣區域或10個缺損（對照組）的30個感興趣區域中的體內骨形成。數據代表相應AOI的平均值和標準偏差。
