DOI:10.1016/j.polymer.2020.122606
體積肌肉缺失（VML）使骨骼肌的天然再生能力不堪重負，并且幾乎沒有有效的方法來恢復失去的肌肉質量和功能。構建旨在促進神經肌肉再生的組織工程肌肉是一種有前途的治療途徑。迄今為止，還沒有研發出結合了促進神經肌肉再生藥物的工程化肌肉構建體用于VML治療。在此，研究者采用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，即聚集蛋白，對本身具有促進肌肉再生潛力的電紡纖維蛋白微纖維束進行修飾，以刺激VML后的神經支配。用可溶性或化學栓系聚集蛋白在微纖維束上培養的成肌細胞顯示乙酰基膽堿受體（AChR）的聚集顯著增加，可溶性聚集蛋白在整個肌纖維束中均顯示AChR簇，而栓系聚集蛋白僅在距基底表面10 μm處顯示AChR簇。植入小鼠VML缺損4周后，與不含聚集蛋白的對照相比，用可溶性或栓系聚集蛋白預處理的構建體導致缺損部位出現顯著增加的神經肌肉接頭、肌纖維再生、血管浸潤、神經浸潤以及核yes-相關蛋白（YAP）表達。與含可溶性聚集蛋白的構建體相比，在植入后4周內，栓系聚集蛋白微纖維束在再生位點內提供了持續的聚集蛋白信號傳導，并且進一步增加了再生組織中再生肌纖維的密度，具有統計學意義。這些數據顯示了預處理的工程肌肉構建體的神經肌肉再生潛力，以在VML再生部位實現由局部遞送的聚集蛋白誘導AChR聚集。
圖1.可溶性和栓系聚集蛋白增加了乙酰膽堿受體的聚集，并在3D肌肉結構中產生了空間效應。A）示意圖，顯示了在電紡纖維蛋白微纖維束上的聚集蛋白系留和細胞接種。B）細胞接種支架橫截面的Masson三色染色，表明栓系聚集蛋白支架的交聯密度不同。C）在所有組中，對齊的肌管對肌球蛋白重鏈呈陽性（MHC，綠色），這表明在聚集蛋白治療組中AChR簇對α-銀環蛇毒素（αBTX，紅色）呈陽性。D）在聚集蛋白治療組中，AChR簇的密度顯著增加。E，F）在聚集蛋白治療組中單個AChR簇的面積和長度顯著高于不含聚集蛋白構建體中的簇。G）MHC和αBTX免疫組化染色的細胞接種栓系聚集蛋白支架的橫截面，表明了AChR簇在支架表面的空間位置。H）各組之間AChR簇的空間位置存在顯著性差異：栓系聚集蛋白誘導的AChR簇靠近支架表面，而可溶性聚集蛋白誘導的AChR簇則與距支架表面的距離無關。*：p<0.05；***：p<0.001
圖2.在無聚集蛋白和聚集蛋白治療組中，VML缺損后的肌肉功能得到了同樣的改善。A）支架植入時和植入后4周，無聚集蛋白、可溶性和栓系聚集蛋白構建體的總體形態。B）Masson三色染色的脛骨前肌橫截面，兩組之間的缺損區域（黃色虛線）和形態不同。C，D）各組之間收集的TA重量和橫截面缺損尺寸存在差異。E，F）在治療組之間沒有觀察到肌肉功能的差異。綠線：年齡匹配的未損傷TA肌肉的平均最大扭矩；紅線：受傷后4周未治療的VML缺損的平均最大扭矩。**：p<0.01；***：p<0.001
圖3.用可溶性和栓系聚集蛋白構建體進行VML治療會增加體內NMJ的形成。A）移植肌的橫截面染色，其中有肌球蛋白重鏈（MHC，綠色）、神經絲（β3T，青色）和乙酰膽堿受體（αBTX，紅色），缺損區域內肌管陽性區域密集且存在NMJs（白色虛線）。B）與其他治療組相比，栓系聚集蛋白構建體導致缺損區域內的總肌纖維面積更大。C）栓系聚集蛋白構建體在缺損區域的神經總面積比其他治療組更多。D）可溶性和栓系聚集蛋白構建體導致NMJ中AChR簇百分比高于無聚集蛋白的對照組。*：p<0.05；**：p<0.01
圖4.與宿主肌肉相比，在植入的栓系聚集蛋白構建體內和周圍，肌肉干細胞、血管和神經蛋白上調。A）用栓系聚集蛋白構建體處理的TA橫截面的低倍放大圖像，并對（i）Pax7（紅色）、CD31（綠色）和β3-微管蛋白（青色）、（ii）僅CD31或（iii）僅β3-微管蛋白進行免疫組化染色。虛線：缺損區域；實線：未降解的支架區域。插圖：三個具有相應高倍放大圖像的區域，顯示宿主肌肉（藍色插圖）、宿主缺損邊界（紅色插圖）以及缺損區域內但在植入的支架之間（綠色插圖）蛋白質表達的變化。B）高倍放大的宿主肌肉圖像，Pax7、CD31和β3T染色水平較低。C）缺損區域內宿主肌肉與植入的栓系聚集蛋白支架之間邊界的高倍放大圖像。缺損區域內可見Pax7、CD31和β3T表達增加。D）在缺損區域內但在植入支架之間的高倍放大圖像。支架之間的Pax7和CD31仍在上調，但β3T表達降低。
圖5.栓系聚集蛋白增加了VML缺損中肌纖維、血管和衛星細胞的再生。A）通過胚胎肌球蛋白（eMHC，紅色）和血管（CD31，綠色）的免疫染色可以看出各組之間缺損位點（白色虛線）內的表達差異。插圖：高倍率圖像。B）衛星細胞（Pax7，綠色）和絲狀肌動蛋白（F-肌動蛋白，紅色）的免疫染色顯示治療組之間衛星細胞募集的差異。C）用栓系聚集蛋白處理的缺損比零或可溶性聚集蛋白基團包含更多的核。D）栓系聚集蛋白導致缺損區域內的胚胎肌球蛋白陽性面積明顯高于零或可溶性聚集蛋白。E）所有治療組之間的總血管覆蓋率存在顯著性差異，其中栓系聚集蛋白誘導的缺損部位內CD31區域數量最多。F）栓系聚集蛋白構建體在缺損區域內的Pax7面積比零或可溶性聚集蛋白高。*：p<0.05；***：p<0.001
