DOI:10.1038/s41598-020-65064-3
心肌組織工程策略具有在心肌梗塞后再生功能性心肌的潛力。在這項研究中，利用不同硬度（50.0±11.2 kPa和90.0±16.4 kPa）的新型電紡纖維蛋白微纖維片材來設計血管化心臟組織的仿生模型。研究者表征了培養在這些片材上的新生大鼠心室心肌細胞（NRVCMs）的組織組裝、電生理和收縮性。在較軟基質上培養的NRVCMs表現出更高的傳導速度（CVs）和改善的電生理特性。當與人脂肪來源的干/基質細胞（hASCs）共培養時，人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）在片材上形成致密的網絡。為了獲得血管化的心臟組織，研究者測試了NRVCM:hASC:HUVEC的不同培養方案，發現1,500,000:37,500:150,000個細胞/cm2的比例能夠形成堅固的內皮網絡，同時保持與僅NRVCM相同的統計學電生理特性。以這種比率在90 kPa基底上進行培養時，其平均CVs為14±0.6 cm/s，動作電位持續時間（APD）80和APD30分別為152±11 ms和71±6 ms，最大捕獲率（MCR）在3.9±0.7 Hz時獲得。這些數據表明，作為生理性3D心臟模型，在體外產生緊密堆積的內皮網絡以及電整合的心臟細胞的潛力巨大。
圖1.實驗設計示意圖。制備并表征了兩種濃度（0.75％和2.0％纖維蛋白）的纖維蛋白微纖維片。將NRVCMs以不同的播種密度培養在纖維蛋白微纖維片上以確定合適的培養條件。最初嘗試將與之前單層研究類似的細胞培養比例用于三培養。由于此操作不成功，因此采用了分步共培養方法。進行NRVCMs和hASCs的共培養以確定hASCs的最大濃度。NRVCMs和hASCs共培養物以1500:37.5:0的比例進行光學映射。使用hASCs和HUVECs的共培養來表征血管發育。在hASC:HUVEC比例為0:37.5:75和0:37.5:150時獲得了最佳的血管網絡。該信息作為體外移植的三培養條件。
圖2.纖維蛋白微纖維片的開發和表征。（A）用于制備纖維蛋白微纖維片的靜電紡絲工藝示意圖。（B）代表性SEM圖像，比較了脫細胞或天然心肌與去細胞或NRVCM接種的纖維蛋白微纖維片。（C）塊狀纖維蛋白微纖維片材的應力-應變曲線，描述了每種纖維蛋白濃度的楊氏模量。（D）聚酯薄膜框架上1cm×1cm纖維蛋白微纖維片的代表性圖像。黃色虛線表示聚酯薄膜框架的內部邊緣和支架的邊界。
圖3.纖維蛋白微纖維片上的心肌細胞的形態和電生理特性（A）在0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維片材上均進行α-肌動蛋白（綠色）和連接蛋白-43（紅色）的免疫熒光染色。（B）選擇0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維心肌細胞組的代表性時間進程（14、28和56天）激活圖。（C）培養2周后，在1.0 Hz的起搏速率下纖維蛋白微纖維的各向異性比率為0.75％和2.0％。（D）在1.0 Hz的起搏速率下0.75％纖維蛋白微纖維從中心起搏的代表性激活圖。（E-H）比較0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維的傳導速度（E）、APD80（F）APD30（G）和最大捕獲率（H）（n=4-9）。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
圖4.纖維蛋白微纖維片的收縮力測量值。（A）0.75％纖維蛋白微纖維的代表性自發力示蹤測量。（B）2.0％纖維蛋白微纖維的代表性自發力示蹤測量。（C）0.75％（黑色）和2.0％（紅色）纖維蛋白微纖維在1 Hz時的代表性刺激收縮力。（D）高達20％應變的纖維蛋白微纖維的受力與長度的關系。
圖5.纖維蛋白微纖維片上血管發育的特征。（A）纖維蛋白微纖維上血管發育的示意圖。（B）培養7天后對血管組件進行免疫染色，（C）含2％和6％血清的已組裝內皮網絡的血管長度，（D）含2％和6％血清的已組裝血管的互連性，（E）正交視圖顯示在纖維蛋白微纖維上免疫染色的血管。
圖6.帶有內皮網絡的功能性心臟移植物。（A）示意圖顯示CM培養14天后，支持細胞（hASC和HUVECs）類型的補播種。（B）分別在0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維片上對CD31/PECAM-1（綠色）管狀結構以及心臟肌鈣蛋白I（紅色）進行免疫熒光染色，細胞濃度范圍為1500:37.5:37.5-1500:37.5:150。（C）在三培養中滴度的內皮細胞間血管長度的比較,（D）在三培養中形成的血管結構的互連性的比較。（E）0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維片在1500:37.5:150比例下的代表性激活圖譜。（F）在0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維中，與僅NRVCM培養物相比，三培養物的傳導速度。（G）0.75％和2.0％纖維蛋白微纖維的動作電位持續時間80和（H）動作電位持續時間30的比較。（I）最大捕獲率比較了纖維韌度和NRVCM:hASC:HUVECs的比率。p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
圖7.帶有內皮網絡的工程化心臟組織受刺激的收縮力。（A）2.0％纖維蛋白（紅色）覆蓋0.75％纖維蛋白（黑色）三培養補片收縮力的點步態軌跡，（B）三培養體系收縮力測量的圖示。
