DOI:10.1016/j.colsurfb.2020.111124
本研究已從節肢動物（Ap）轉錄組中鑒定出轉谷氨酰胺酶（TG）的抗氧化功能。從轉谷氨酰胺酶核心結構域中預測出抗氧化肽ML11（MLRSIGIPARL），并評估了該肽的自由基清除能力，結果表明其以劑量依賴性的方式發揮作用。在人血白細胞中分析了ML11肽的細胞毒性，在任何細胞群中均未產生細胞毒性。此外，通過靜電紡絲技術制備了包封抗氧化肽ML11的納米纖維氈。與殼聚糖聚乙烯醇共混墊相比，包封抗氧化肽ML11的纖維墊顯示出纖維直徑有所增加。通過X射線衍射法測定了殼聚糖和聚乙烯醇聚合物在20～30℃（2θ°）的寬頻帶上結晶行為向非晶態的變化。FTIR表明了聚合物中存在的官能團以及殼聚糖（CS）和聚乙烯醇（PVA）的組分之間的相互作用。流式細胞術和熒光顯微鏡證實，纖維通過清除細胞內ROS而包裹肽，從而保持抗氧化活性。包封ML11肽的墊在NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細胞中未顯示細胞毒性。同樣，包封ML11肽的纖維在NIH-3T3細胞中顯示出潛在的傷口愈合活性。總而言之，該研究表明具有傷口愈合潛力的包封ML11肽的納米纖維墊可用作生物藥物。
圖1.H2O2處理后ApTG的基因表達譜。通過qRT-PCR在不同時間（0、5、10、15和20天）測量過氧化氫激發后轉谷氨酰胺酶在高原梭菌中的調控表達。在治療后第15天（點），發現ApTG mRNA的表達升高，并且在治療后第20天觀察到表達的降低。星號（*）表示在GraphPad棱鏡（8.0.2版）中通過雙向ANOVA和Sidak檢驗得出的對照（第0天）與處理（第5、10、15和20天）之間的顯著性差異。
圖2.ML11肽的抗氧化活性。（A）與Trolox的DPPH自由基清除能力相比，ML11肽具有顯著的DPPH自由基猝滅活性。（B）TEAC分析顯示ML11在清除ABTS自由基方面具有劑量依賴性trolox等效容量。（C）HRSA分析顯示ML11抑制羥基自由基的能力。（D）將ML11的超氧化物自由基清除活性與Trolox進行了比較，其中ML11的自由基清除活性優于Trolox。所有測試均一式三份進行，其值用平均值±標準差（n=3）表示。星號（*）表示陽性對照組（Trolox）與在GraphPad棱鏡（8.0.2版）中通過雙向ANOVA和Sidak檢驗測得的處理組之間的顯著性差異。
圖3.ML11肽對人PBMCs的細胞內ROS淬滅活性。通過熒光探針DCFDA使用FACS評估PBMCs中的細胞內ROS水平：（A）暴露于2 mM H2O2后的血糖譜；（B）由于細胞內ROS水平升高引起的DCFDA熒光位移；（C）由于PBMCs中ROS水平升高，直方圖顯示在暴露于2 mM H2O2時強烈的熒光峰移動；（D）用H2O2（2mM）和ML11肽處理后的血液分布。（E）由于ML11肽ROS清除活性引起的熒光變化；（F）直方圖顯示由于低白細胞ROS而沒有熒光峰移動。數據表示為平均±SD（n=3）。熒光成像揭示了通過熒光顯微鏡捕獲的細胞內ROS的水平：（G）暗場圖像顯示了用H2O2處理的白細胞中ROS-DCFDA復合物的熒光；（H）顯示實際細胞的明場圖像；（I）經ML11處理的肽細胞中細胞內ROS水平降低的暗場圖像；（J）顯示實際細胞的明場圖像。光學顯微圖像（G，H，I和J）的比例尺為20 μm。
圖4.ML11對人血白細胞的細胞毒性。當存在或不存在100μM ML11肽時，針對血液白細胞評估ML11細胞毒性。對于陽性和陰性對照，分別使用Triton X-100和PBS。在血白細胞中，ML11肽未顯示任何明顯的細胞毒性。數據表示為平均值±SD（n=3）。星號（*）表示在GraphPad棱鏡（8.0.2版）中通過雙向方差分析和Sidak檢驗，陽性對照組（Triton X-100）與治療組（100 μM）之間存在顯著性差異。
圖5.包封ML11的CS-PVA氈的FE-SEM分析。（A）CS-PVA 1:3；（B）CS-PVA 1.5:3；（C）CS-PVA 2:3，顯示隨機排列且無珠的結構纖維；（D）包封ML11肽的CS-PVA墊；（E）1:3 CS-PVA的纖維直徑分布；（F）1.5:3 CS-PVA的纖維直徑分布；（G）2:3 CS-PVA的纖維直徑分布；（H）包封ML11的CS-PVA（1.5:3）墊的纖維直徑。
圖6.包封ML 11肽的CS-PVA墊對降低ROS的作用。采用流式細胞儀（FACS）分析DCFDA染料對人血白細胞氧化應激的降低作用。（A）直方圖描繪了熒光的變化，證實了過氧化氫處理的白細胞樣品中氧化應激水平的增加。（B）直方圖圖像顯示了熒光強度的降低，證實了CS-PVA氈處理的白細胞中的氧化應激濃度水平降低。（C）直方圖顯示熒光強度沒有變化，這證實了肽處理的白細胞樣品中氧化應激的降低程度更大。所有數據均以平均值±SD表示，n=3。共聚焦顯微鏡研究表明白細胞的細胞內氧化應激降低。（D）暗場圖像通過熒光強度說明了過氧化氫處理的白細胞中氧化應激的存在，而明場圖像顯示白細胞。（E）暗場圖像顯示了CS-PVA對照墊處理的細胞中熒光強度的輕微降，而明場圖像顯示白細胞。（F）暗場圖像顯示無熒光強度，這證實了CS-PVA-ML11墊處理的細胞中氧化應激降低，而明場圖像顯示白細胞。所有數據均以平均值±SD表示，n=3。
圖7.包封ML11的CS-PVA墊對NIH-3T3細胞的影響。使用處理過的和未處理過的ML11肽在小鼠成纖維細胞中評估NIH-3T3細胞的增殖和遷移；（A）包封ML11的CS-PVA墊的細胞毒性作用決定了細胞的活力和細胞的增殖。針對包封ML11的CS-PVA墊測定了NIH-3T3的細胞活力。磷酸鹽緩沖液用作對照，包封ML11肽的CS-PVA墊對NIH-3T3細胞無細胞毒性作用。星號（*）表示對照組與處理組在統計學上有所不同。數據表示為平均值和標準偏差，其中n=3，p≤0.05。（B）觀察細胞在第0 h單層損傷后的增殖和遷移情況。（C）在24 h用ML11肽處理的墊顯示13.79％的封閉活性。（D）在48 h用肽處理的墊顯示出72.41％的傷口封閉活性。（E）肽處理的細胞在72 h表現出98.62％的封閉活性。光學顯微圖像（B，C，D和E）的比例尺為20 μm。
