DOI:10.3390/cells9051207
受傷肌腱的再生極具挑戰性。而組織工程是一個很有前途的解決方案。本研究驗證了這樣一個假設，即羊膜上皮細胞(AECs)的反應可以通過模擬肌腱的纖維直徑大小來調節。尤其是，對具有兩種不同直徑尺寸（分別為1.27和2.5 μm：ha1-和ha2-PLGA）的高度定向微纖維的電紡聚丙交酯-乙交酯（PLGA）的AECs能力進行了測試，通過分析肌腱相關標記物（I型膠原：COL1蛋白和mRNA硬化：SCX，Tenomodulin：TNMD和COL1基因表達）測定其向十種基因譜系分化的能力，并且通過研究促（IL-6和IL-12）和抗（IL-4和IL-10）炎癥細胞因子測定了其免疫調節性能。觀察到，纖維排列而不是纖維尺寸影響細胞形態，這決定了AECs從立方體到梭形肌腱樣的形態變化。相反，羊毛的機械性能、細胞增殖、肌腱分化和免疫調節是通過改變ha-PLGA超細纖維直徑大小來調節的。具體而言，在ha2-PLGA上發現了更高的DNA量和更好的羊毛滲透性，而纖維直徑較小的ha1-PLGA羊毛具有較好的機械特性，通過將SCX更有效地轉化為下游效應物TNMD，從而在AECs向十種基因譜系的轉分化上更高效。而且，相對于2.5μm的纖維直徑，1.27μm的纖維直徑以有利的IL-12/IL-10比率誘導了更高的促再生、抗炎性白細胞介素mRNA表達（IL-4和IL-10）。結果表明，纖維直徑是設計用于組織修復的肌腱仿生纖維時要考慮的關鍵因素，并為控制基質參數在增強細胞分化和免疫調節中的重要性提供了新的見解，無論是移植的宿主組織內功能化的細胞還是移植的宿主組織。
圖1.電紡PLGA超細纖維的形態特征。（A和B）具有1.27±0.11 μm（ha1-PLGA）和2.5±0.27 μm（ha2-PLGA）高度定向PLGA的SEM顯微照片，顯示無缺陷的羊毛（每種類型的羊毛n=3）。比例尺=10 μm。（C）ha1-和ha2-PLGA羊毛內纖維取向的頻率分布。兩種PLGA羊毛纖維均顯示一條急彎高斯曲線，其取向角主要在-10°到+10°之間，并且在纖維直徑較小的情況下，高度纖維排列具有統計學顯著性（ha1-PLGA，p<0.05）（每種羊毛n=3）。
圖2. ha1-和ha2-PLGA超細纖維的纖維直徑和孔徑。（A）直方圖顯示ha1-PLGA超細纖維的直徑尺寸為1.27±0.11 μm（ha1-PLGA），而ha2-PLGA超細纖維的直徑尺寸為2.5±0.27 μm。****ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛之間具有統計學顯著性（p<0.0001）。（B）PLGA羊毛中孔徑的頻率分布，其中ha1-PLGA的平均孔徑為2.37±0.24 μm，ha2-PLGA的平均孔徑為3.92±0.39 μm。（C）比較結果表明，ha-PLGA羊毛的纖維直徑尺寸增加，同時孔徑顯著增加（p<0.0001）（每種類型羊毛n=3）。
圖3.ha1-和ha2-PLGA羊毛在滅菌前后的代表性FTIR光譜。光譜顯示滅菌前后，純ha1-和ha2-PLGA羊毛的化學組成沒有差異。PLGA表征的官能團如下：酯羰基伸展（C=O）的1748 cm-1處，醚基伸展（C-O-C）的1085 cm-1處，以及甲基伸展（C-H）和（C-CH3）的1452和1044 cm-1處。
圖4. ha1-和ha2-PLGA羊毛的機械特性。（A）最大負荷（N）；（B）斷裂應變（％）； （C）極限抗拉強度（MPa）；（D）在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上進行的楊氏模量（MPa）測定（每種類型羊毛n=5，羊毛尺寸：50 mm×15 mm）。與ha1-PLGA相比，電紡ha2-PLGA羊毛具有更高的斷裂應變值，而與ha2-PLGA相比，ha1-PLGA羊毛具有更高的楊氏模量值。****ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛之間具有統計學顯著性（p<0.0001）。
圖5.細胞接種效率和纖維直徑尺寸對oAECs增殖的影響。將細胞接種在陪替氏培養皿（oAEC）或ha1-PLGA和ha2-PLGA電紡羊毛上，并使其生長長達48小時。（A）培養4小時和48小時后，通過Qubit?dsDNA HS分析對培養皿或接種的羊毛上的oAECs進行DNA定量，以驗證細胞粘附性、接種效率并評估DNA量。結果表明，培養48小時后，與ha1-PLGA相比，ha2-PLGA的增殖速率更高。****同一樣本類型在不同時間點具有統計學顯著性（p<0.0001）。°°°°在48小時不同樣本類型之間的統計顯著性（p <0.0001）（每種樣本/分析/時間點n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。（B）比較顯示，在培養48小時后，與ha1-PLGA相比，ha2-PLGA的DNA量顯著增加（p<0.0001），從而證明了ha-PLGA羊毛孔徑的增加伴隨著細胞增殖速率的增加。
圖6.羊膜上皮干細胞（AEC）的活力和在ha1-和ha2-PLGA羊毛上的分布。（A和B）代表性圖像，評估在兩種類型羊毛上用鈣黃綠素AM /碘化丙啶（PI）染色（分別為綠色和紅色熒光）培養7天的oAECs的存活情況，其中只有活細胞可見，為綠色。細胞核用Hoechst 3342（藍色熒光）復染，比例尺=50 μm。（C）直方圖，顯示培養24 h、48 h和7天后，接種在ha1-PLGA或ha2-PLGA羊毛上的細胞的oAECs活力。三組間無統計學差異（p>0.05）；（對于每種類型羊毛/時間點，n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。（D-G）代表性XY共聚焦圖像，顯示培養24 h和48 h后ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛內的oAECs分布。深度編碼的MaxIP分析用于通過定義與細胞方向相關的漸變顏色來評估羊毛中的細胞穿透（可見為淺色背景）。漸變標度的紫色是指羊毛的表面，而紅色是指表面的底部。因此，最表面的細胞質細胞顯示為綠色，而位于羊毛底部的細胞的細胞質顯示為紅色。同樣明顯的是，oAECs在羊毛中具有最佳的分布，尤其是在培養24小時后的ha2-PLGA中，而在培養48小時后的ha1-和ha2-PLGA羊毛之間，在細胞滲透方面沒有差異。插圖顯示了用MaxIP分析的相同鬼筆環肽標記的細胞顯微照片。從這些圖像中可以明顯看出，附著在定向纖維上的細胞呈梭狀形態。從明場曝光中捕獲的羊毛顯示細胞與纖維平行排列。比例尺=50 μm。
圖7.oAECs在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上的形態。（A）由鬼筆環肽染色（紅色熒光）證實oAECs形態的代表性共聚焦圖像，其中用DAPI復染的核（藍色熒光）。顯然，陪替氏培養皿上的oAECs保持其典型的上皮形狀，而在ha1-和ha2-PLGA羊毛上培養24小時時，它們就已經獲得了肌腱細胞樣的細長形態。比例尺=50 μm。（B）在ha-PLGA羊毛上接種24小時和48小時后伸長的oAECs的百分比。****每個時間點不同研究組之間的統計學顯著性值（p<0.0001）。（C）接種在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上24小時和48小時后細胞核長寬比的百分比。 ****每個時間點不同研究組之間的統計學顯著性值（p<0.0001）。§同一組在不同時間點的統計顯著性值（p<0.0001）（對于每種類型羊毛/分析，n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。
圖8.ha1-和ha2-PLGA羊毛在AECs上的張力感應特性。IHC分析顯示，當接種到ha1-PLGA和ha2-PLGA上時，oAEsC中的COL1蛋白表達（紅色熒光）。而培養皿上培養的細胞不表達蛋白質。DAPI（藍色熒光）染色細胞核。圖像顯示，接種在培養皿上的細胞從不表達COL1，而在培養了24小時的ha1-和h2-PLGA羊毛上培養的AECs中卻表達了COL1。在帶有肌腱樣形態的oAECs的細胞質中，COL1的陽性率是明顯的。比例尺=50 μm（每種樣品/時間點n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。
圖9.ha-PLGA羊毛在AECs上的張力感應特性。在24 h和48 h培養點評估SCX、COL1和TNMD基因表達。定量RT-PCR數據顯示，與培養皿上的oAECs相比，接種到ha-PLGA羊毛上的oAECs中的腱生標記的表達明顯更高（參照樣本oAECs在24 h時為1）（每種樣品/分析/時間點n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。*在每個時間點不同組之間的統計顯著性（p <0.05）。**在每個時間點不同組之間的統計顯著性（p<0.01）。***在每個時間點不同組之間的統計顯著性（p<0.001）。 ****在每個時間點不同組之間的統計顯著性（p<0.0001）。°同一組在不同時間點具有統計學顯著性（p<0.05）。°°在同一組中不同時間點具有統計學顯著性（p<0.01）。
圖10.接種在ha1-和ha2-PLGA羊毛上的oAECs中的抗炎和促炎ILs表達譜。 （A和B）在oAECs中以及培養24小時、48小時和7天后在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上接種的oAECs中研究了促炎性IL-6和IL-12以及（C和D）抗炎性IL-10和IL-4 mRNA的表達。在培養皿上培養24小時后的oAECs用作參照樣品（24小時的oAECs為1）。（E）培養7天（7d）后，oAECs中和接種在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上的oAECs中的表達水平的IL-12/IL-10比。在陪替氏培養皿上培養7天后的oAECs用作參照樣品（7d的oAECs為1）。使用ΔΔCt方法進行相對定量，并將GAPDH用作管家基因。數據是在從至少3個胎兒（n=3次生物學重復實驗）收集的oAECs中進行的3次重復實驗（n=3次重復實驗）的平均值±SD。*在每個時間點不同組之間具有統計學顯著性（p<0.05）。**在每個時間點不同組之間具有統計學顯著性（p<0.01）。***在每個時間點不同組之間具有統計學顯著性（p<0.001）。****在每個時間點不同組之間具有統計學顯著性（p<0.0001）。
