Biomater. Sci.：聚多巴胺輔助腺苷一步修飾納米纖維表面，以調節間充質干細胞的成骨

DOI: 10.1039/C9BM01990A

腺苷及其受體已成為控制骨愈合細胞功能的替代靶點。然而，由于腺苷在體內的快速降解，其可溶性遞送并沒有被證明是有效的。因此，研究者通過聚多巴胺化學性質設計了一種穩定的生物材料表面腺苷涂層，以通過A2bR信號控制成骨和破骨細胞生成。首先，研究者制備了電紡聚乳酸（PLLA）納米纖維片材，并通過一步腺苷-聚多巴胺涂層工藝對其進行改性。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示，與僅聚多巴胺的片材相比，在腺苷-聚多巴胺涂覆的PLLA（AP-PL）片材上有顆粒沉積。此外，X射線光電子能譜分析證實了腺苷引起氮信號的增加。此外，與僅聚多巴胺的片材相比，AP-PL片材的腺苷負載效率和保留率顯著提高。在AP-PL上培養的人脂肪干細胞（hADSCs）表達的A2bR（1.30±0.19倍）明顯高于在僅聚多巴胺片材上培養的水平。這反過來顯著提高了生長培養基中生長的細胞在14天和21天的Runx2（16.94±1.68和51.69±0.07倍）、OPN（1.63±0.16和30.56±0.25倍）、OCN（1.16±0.13和5.23±0.16倍）和OSX（10.01±0.81）的表達。同樣，AP-PL組的礦物質沉積比聚多巴胺組的增強程度更大，而A2bR的阻斷則顯著下調了成骨作用。最后，AP-PL片上的生長顯著抑制了RAW 264.7細胞的破骨細胞分化。但是，阻斷A2bR后破骨細胞分化得到明顯促進。綜上所述，聚多巴胺輔助腺苷一步涂層是一種可行的生物材料表面修飾方法，以控制干細胞的成骨分化和骨愈合。

圖1.在PLLA（PL）納米纖維上一步涂覆腺苷（1 mg/ml）聚多巴胺（2mg/ml）的示意圖以及誘導腺苷2b受體（A2bR）信號的示意圖。

圖2.a）PL、腺苷涂層的PL（A-PL）、聚多巴胺涂層的PL（P-PL）和一步涂覆腺苷聚多巴胺的PL（AP-PL）納米纖維片的SEM顯微照片；b）納米纖維的水接觸角（n=4）； c）納米纖維的微型BCA分析（n=4）。使用單向方差分析，分別與PL和A-PL相比，*和?P<0.05。

圖3.通過XPS評估的PL、A-PL、P-PL和AP-PL的表面化學成分：a）寬掃描；b）氮（N1s）光譜；c）高分辨率碳（C1s）光譜。

圖4.a）估計A-PL和AP-PL中的腺苷涂層效率（n=4）（使用學生t檢驗，*P<0.05），b）A-PL和P-PL中腺苷的分離曲線。

圖5.納米纖維對細胞粘附、增殖和A2bR表達的影響的評估：a）第7天在P-PL和AP-PL上培養的hADSCs的F-肌動蛋白染色；b）在PL、A-PL、P PL和AP-PL上培養的hADSCs的DNA分析（n=4，使用雙向方差分析，*P<0.05）；c）第14天在P-PL和AP-PL上培養的hADSCs的A2bR染色；d）第14天hADSCs中A2bR基因的相對表達，每組（n=4）用其管家基因GAPDH標準化，然后將所有組在生長培養基（GM）中標準化為P-PL。通過單向方差分析評估統計學差異，表明分別與GM、A-PL和AP-PL中的P-PL相比，?、?和§P<0.05。

圖6.成骨標志物在納米纖維上培養的hADSCs中的表達：在生長培養基（GM）和成骨培養基（OM）中第14天的a）Runx2、b）OPN、c）OCN、d）OSX和第21天的e）Runx2、f）OPN、g）OCN、h）OSX（n=4，單向方差分析其顯著性，與P-PL、A-PL和AP-PL相比，表示為?、?和§P<0.05）。

圖7.礦物沉積分析：a）第14天和第21天，P-PL、A-PL、AP-PL和P-PL（OM）的茜素紅S染色（n=4）；在b）第14天和c）第21天進行鈣分析（使用單向方差分析，分別與P-PL、A-PL和AP-PL相比，?、?和§P<0.05）。d）在第21天進行礦物沉積的SEM分析以及hADSC培養21天后，在e）GM的P-PL、f）GM的AP-PL和g）OM納米纖維的P-PL中進行礦物沉積的XPS分析。

圖8.第14天，PSB 603處理對a）Runx2、b）OPN和c）OSX相對表達水平的影響（n=4，使用單向方差分析，?P<0.05）。d）P-PL、AP-PL和P-PL（OM）中用/不用PSB 603處理的Runx2和OPN標志物的免疫熒光染色（比例尺=200 μm）。

圖9.a）在P-PL和AP-PL納米纖維上培養的RAW 264.7細胞中，F-肌動蛋白和A2bR受體的免疫染色。b）在P-PL和AP-PL納米纖維上的RAW 264.7細胞中A2bR的相對表達水平（n=4，使用學生t檢驗，*P<0.05）。c）在P-PL和AP-PL上培養的RAW 264.7細胞的TRAP分析（n=4，使用單向方差分析，*P<0.05）。d）TRAP、e）RANKL、f）NFATc1和g）CTSK的相對表達水平（n=4，使用單向方差分析，*P<0.05），h）IL-10和i）TNF-α在培養于納米纖維上的RAW 264.7細胞中的相對表達水平（n=4，使用學生t檢驗，*P<0.05）。

圖10.PSB 603對a）TRAP、b）RANKL、c）NFATC1、d）CTSK、e）IL-10和f）TNF-α表達的影響（n=4，使用單向方差分析，*P<0.05）。g）A2bR信號控制成骨細胞分化的示意圖。